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1目的黄连-干姜药对应用广泛、配比众多,但其提取工艺及不同配比对活性成分的影响尚无人研究。黄连、干姜具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等药效,且均为高频抗肿瘤药物,小檗碱、黄连碱、6-姜酚均对胃癌细胞有抑制作用,而黄连-干姜药对抗胃癌药效尚无人研究。为了优选黄连-干姜药对提取工艺,明确抗胃癌活性成分、药效及其机制,本论文开展了黄连-干姜药对活性成分提取工艺、不同配比对黄连成分影响研究,在此基础上,进行不同配比黄连-干姜药对抗胃癌细胞谱效关系研究及体内外抗胃癌药效及机制研究,为进一步拓展黄连-干姜药对临床作用提供参考。2方法2.1黄连-干姜不同配比对黄连成分提取率的影响研究黄连-干姜药对等量(1:1)配比,以药物粒度、溶剂、提取次数、提取时间、溶剂比例为考察因素,主要成分黄连碱、巴马汀、表小檗碱、小檗碱、6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量为指标进行综合评分,优化黄连干姜药对的提取工艺。运用高效液相色谱,对不同配比黄连-干姜药对醇提物及水煎液中生物碱成分小檗碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、非洲防己碱进行含量测定,比较黄连-干姜药对不同配比及不同提取方法对生物碱成分提取率的影响。2.2黄连-干姜不同配比体外抗胃癌谱效关系研究将12种不同配比黄连-干姜药对醇提后得醇提物,采用HPLC法建立12种不同配比黄连-干姜药对醇提物的指纹图谱并进行共有峰指认;以人胃癌细胞SGC7901的抑制率为药效指标,考察不同配比药对醇提物的体外抗胃癌药效。采用灰色关联度分析法分析黄连-干姜醇提物指纹图谱中各共有峰与药效的关联度。2.3黄连-干姜药对抗胃癌药效研究以裸鼠为研究对象,腋下注射小鼠胃癌细胞MFC造皮下肿瘤模型。分为4个组别,除空白对照组,其余分别给予50、100 mg·kg-1黄连-干姜1:1药对和10 mg·kg-1顺铂,检测肿瘤体积、重量,进行HE及Ki67染色,检测黄连-干姜药对体内抗胃癌药效。使用人胃癌细胞系SGC7901和小鼠胃癌细胞系MFC进行体外抗胃癌药效研究。采用MTT与CCK8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,划痕实验检测细胞迁移,transwell法检测细胞侵袭。2.4黄连-干姜药对抗胃癌机制研究采用转录组测序、代谢组学等多组学进行机制研究。以人胃癌细胞系SGC7901为研究对象,分为空白对照组与黄连-干姜药对给药组,进行转录组测序。采用GC-MS进行代谢组学研究,通过GO、KEGG分析代谢通路,通过RT-PCR进行验证。3结果3.1黄连-干姜不同配比对黄连成分提取率的影响研究确定黄连干姜药对的提取工艺为:取黄连、干姜饮片等量,粉碎成粗粉(过2号筛)后置于回流提取器中,加8倍70%乙醇,回流提取两次,每次1h。优化提取工艺后,主要成分小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱的含量分别为9.02%、2.45%、2.30%、1.47%,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量分别为0.39%、0.13%、0.03%。同配比的样品中醇提液中黄连生物碱的含量大于水提液中的含量,即醇提法更利于黄连中生物碱的提取。且随着干姜配比的增加,黄连生物碱提取率逐渐降低,因此黄连干姜不同配比会影响黄连生物碱的提取率。3.2黄连-干姜不同配比体外抗胃癌谱效关系研究12种不同配比黄连-干姜药对醇提物共有13个共有峰,指认出6个成分,分别为非洲防己碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。检测12种不同比例的黄连-干姜药对对胃癌细胞的抑制作用,黄连-干姜比例为1:1时药效最好。经灰色关联度分析发现,13个共有峰与抑制胃癌细胞增殖的关联度均大于0.5,黄连-干姜药对体外抗胃癌药效是多组分共同作用的结果。3.3黄连-干姜药对抗胃癌药效研究黄连-干姜药对在肿瘤异种移植模型中抑制肿瘤发生,抑制MKI67表达。体外抗胃癌实验中,黄连-干姜药对醇提物给药组显著抑制SGC7901、MFC细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成,促进细胞凋亡。在体内外均发挥抗胃癌药效。3.4黄连-干姜药对抗胃癌机制研究根据转录组测序结果,对SGC7901细胞中黄连-干姜药对调控的差异表达基因进行通路富集分析,富集到代谢通路。通过代谢组学数据分析,黄连-干姜药对显著抑制细胞糖代谢,下调LDHA和SLC2A1基因的表达,通过RT-PCR验证,黄连-干姜药对改变LDHA和SLC2A1相关基因ME2、LDHD、LDHB、HIF1A、PKM、Pcx、Got1的表达,通过抑制糖代谢发挥抗胃癌药效。4结论经考察后优化的提取工艺能更好地提取有效成分,为黄连-干姜药对的后续药效研究提供依据。本研究建立了黄连干姜药对醇提物的HPLC指纹图谱,指认了6个共有峰成分;表小檗碱、药根碱、黄连碱、小檗碱与体外抗胃癌药效关联度较大,初步揭示了黄连-干姜药对抗胃癌作用的药效物质基础。黄连-干姜药对抑制SGC7901/MFC胃细胞的增殖、迁移、侵袭,进而通过调节LDHA和SLC2A1基因调控糖代谢抑制肿瘤发生。