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第一部分IGF-1调控小鼠VSMCs增殖和凋亡的研究研究背景:颅内动脉瘤（intracranial aneurysms,IAs）是颅内动脉的管腔局限性扩张形成的异常隆起,其病理改变以颅内动脉管壁内弹力层断裂,中层缺失以及炎性细胞浸润为主。IAs进展过程中,颅内动脉管壁中层缺失的主要原因是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的数量明显减少,而既往研究认为VSMCs的减少主要由其凋亡和自噬水平升高,而增殖水平不足所致。体外研究发现,胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）可通过PI3K/Akt信号通路抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）诱导的VSMCs凋亡;同时,小鼠颈动脉损伤模型中发现,IGF-1水平升高可促进损伤后动脉壁的VSMCs的增殖。此外,关于自噬的研究中发现,VSMCs经过IGF-1预处理后,其自噬相关基因表达水平下降,进而自噬程度被抑制。基于以上研究结果,IGF-1可能通过调控VSMCs的增殖、凋亡和自噬水平,改善血管壁的病理性重构。然而,目前尚无研究表明在IAs的形成和进展过程中,IGF-1有减轻VSMCs凋亡和自噬水平、促进VSMCs增殖的作用。本研究通过体外共培养小鼠主动脉内皮细胞（endothelial cells,ECs）与VSMCs,同时予以梯度壁面切应力（wall shear stress,WSS）刺激ECs,模拟IAs形成过程中的异常血流动力学环境。并对VSMCs予以IGF-1过表达和敲减的外源性干预,探索异常WSS刺激下IGF-1对VSMCs的增殖、凋亡的影响,并初步探索IGF-1与VSMCs自噬水平的关系。研究方法:提取小鼠主动脉的原代ECs与VSMCs,传代至3-5代后,分别接种培养于Transwell小室底部的外侧面和内侧面,后在Flow chamber中培养。使用恒定流动的培养基对Transwell小室外侧面的ECs施加梯度WSS刺激,根据VSMCs的凋亡水平探索正常WSS和高WSS作为实验条件。进而分别使用IGF-1过表达（overexpression,OE）和敲减（knock down,KD）慢病毒（lentivirus）转染VSMCs后,再将其与ECs按照前述方法,在Flow chamber中共培养。将共培养模型分为正常WSS组、高WSS组、高WSS+IGF-1 NC组（空白病毒组）,高WSS+IGF-1 OE组（过表达组）和高WSS+IGF-1 KD组（敲减组）,使用流式细胞术检测VSMCs在不同组之间的凋亡差异,CCK8增殖实验检测VSMCs的增殖水平组间差异,并通过rt-q PCR和WB分别从m RNA水平和蛋白水平检测IGF-1对VSMCs增殖、凋亡和自噬的作用。研究结果:1.细胞流式凋亡结果显示:在梯度WSS刺激后,当WSS为30 dyn/cm2时,VSMCs凋亡比例最低（14.13%）,而当WSS进一步增加到50 dyn/cm2和80 dyn/cm2时,VSMCs凋亡率分别升高至30.94%和43.56%。故将30 dyn/cm2作为下一步研究中正常WSS组,将50 dyn/cm2作为高WSS组。进一步将VSMCs予以IGF-1干预后,细胞流式凋亡实验结果发现,IGF-1 OE组凋亡细胞比例（17.31%）较IGF-1 NC组（31.15%）下降;而IGF-1 KD组凋亡细胞比例（24.64%）较IGF-1 OE组（17.31%）上升。2.CCK8增殖实验结果显示:高WSS组细胞增殖能力较正常WSS组下降。而IGF-1 OE组细胞增殖水平较WSS+NC组增高（P＜0.05）,同时,细胞增殖能力具有时间依赖性（P＜0.05）,在IGF-1 KD组中,VSMCs的细胞增殖能力则较OE组明显降低（P＜0.05）。3.细胞增殖（ki67）及凋亡（Caspase 3）相关指标的m RNA和蛋白表达水平组间对照结果:高WSS组凋亡相关指标Caspase 3的m RNA表达水平较正常WSS组明显升高（P＜0.001）,而IGF-1 OE组Caspase 3的m RNA表达水平较IGF-1 NC组下降（P＜0.001）;在IGF-1 KD组中,Caspase 3表达较IGF-1 OE组上升（P＜0.001）。此外,增殖相关指标（Ki67）在高WSS组中的m RNA表达水平较正常WSS组明显下降（P＜0.001）;而其IGF-1 OE组中较IGF-1 NC组明显增高（P＜0.001）,IGF-1KD组中Ki67的m RNA表达水平则较OE组降低（P＜0.001）。Caspase 3和Ki67的蛋白表达水平结果组间差异也进一步验证了其q PCR的趋势,且组间差异具有统计学意义（P＜0.001）。4.细胞自噬相关蛋白（LC3-II和Beclin-1）的m RNA和蛋白表达水平组间对照结果:q PCR结果显示,二者在高WSS组中较正常WSS组表达增加（P＜0.001）,IGF-1 OE组中的LC3-II（P＜0.001）和Beclin-1（P＜0.001）的表达水平均较IGF-1 NC组下降;在IGF-1 KD组中LC3-II（P＜0.001）和Beclin-1（P＜0.001）表达水平则较IGF-1 OE组增加。二者的蛋白表达水平结果组间差异也具有相同的趋势,且差异具有统计学意义（P＜0.001）。研究结论:在体外共培养的ECs和VSMCs模型中,施加稳定的梯度WSS刺激ECs后,VSMCs的增殖、凋亡和自噬水平会发生变化:当给予的高WSS刺激ECs后,VSMCs的增殖能力下降,而凋亡、自噬水平增加。IGF-1能够促进VSMCs的增殖,而抑制其凋亡和自噬。第二部分小鼠颅内动脉瘤中IGF-1对VSMCs增殖和凋亡的影响研究背景:动脉瘤发生和进展过程是复杂的,既往研究认为,先天变异、血流动力学异常、炎症等多种因素均参与了动脉瘤的发生和进展。而多因素的病理性改变,均导致动脉瘤壁的病理性重构、管壁薄弱,最终致使动脉瘤进展和破裂。第一部分研究中,我们发现高WSS促进了VSMCs的凋亡和自噬,同时抑制了VSMCs的增殖。此外,IGF-1对高WSS引起的VSMCs凋亡和自噬有抑制作用,并且提高了VSMCs的增殖水平。然而IGF-1对于IAs中VSMCs增殖、凋亡和自噬的调控作用,是否可以影响脑血管壁的病理性重构,最终抑制动脉瘤的形成和进展,目前仍无定论。在本部分的研究中,通过构建小鼠IAs模型,并以尾静脉注射的方式予以IGF-1过表达和敲减的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）干预,验证IGF-1是否对小鼠IAs中VSMCs的增殖、凋亡和自噬产生影响,从而影响对脑血管壁的病理性重构产生影响,最终抑制动脉瘤的形成和进展。研究方法:选取8周龄的雄性C57BL/6小鼠100只,将其随机分为4组:假手术组（Sham组,n=25）、动脉瘤组（IA组,n=25）、动脉瘤+IGF-1过表达组（OE组,n=25）和动脉瘤+IGF-1敲减组（KD组,n=25）。假手术组的小鼠仅暴露颈部和腹部皮下组织后缝合;动脉瘤组小鼠予以左侧颈总动脉和左肾结扎,并于右侧颅底前交叉池予以弹性蛋白酶注射;OE组和KD组则在颈动脉、肾动脉结扎注射步骤均完成后予尾静脉IGF-1的OE和KD AAV注射,一周后再予以右侧颅底前交叉池弹性蛋白酶立体定向注射。所有小鼠在颅底弹性蛋白酶注射并饲养4周后,每组随机选取部分（n=5）予以溴酚蓝明胶心脏灌注,后处死小鼠获取颅底Willis环组织标本,显微镜下观察小鼠颅底Willis环的成瘤率并进行组间比较。小鼠颅底Willis环及附带部分脑组织经石蜡固定、组织切片后,进行HE染色及免疫组化检测,观察小鼠颅底的Willis环的病理性重构程度,以及不同组间增殖、凋亡相关蛋白的表达变化情况。同时,取颅底Willis环血管并予以rt-q PCR和WB检测,比较不同组间小鼠颅底血管的VSMCs增殖、凋亡和自噬相关指标在m RNA和蛋白水平的组间表达差异。研究结果:1.小鼠IAs形成情况:Sham组小鼠脑血管未见IAs形成,IA组小鼠脑血管的成瘤率为72%（18/25）,高于假手术组;OE组的成瘤率较动脉瘤组低,为12%（3/25）;而KD组中的成瘤率在四组间最高,为84%（21/25）,组间差异有统计学意义（P＜0.0001）。2.小鼠颅底Willis环的HE染色与免疫组化染色结果显示:与Sham组相比,IA组小鼠的颅底Willis环血管壁中层局部增厚,且可见整体厚薄不均,血管重构现象明显;OE组可见VSMCs增殖现象,管壁稍有增厚,而管壁厚度均匀;而KD组中可见血管显著扩张,管壁菲薄,且镜下可见明显的管壁病理性重构。免疫组化检测结果显示,IA组Caspase 3表达较Sham组明显增加（P＜0.0001）,在OE组中,Caspase3表达较IA组下降（P＜0.0001）,KD组中Caspase 3表达则较OE组表达升高（P＜0.0001）。Tunel蛋白检测结果的组间差异及变化趋势和Caspase 3有相似性,且组间差异具有统计学意义（P＜0.0001）。增殖相关蛋白Ki67在IA组表达较假手术组明显下降（P＜0.0001）,而OE组中Ki67的表达较IA组增加（P＜0.0001）,KD组ki67表达较动脉瘤组中降低（P＜0.0001）。3.小鼠颅底Willis环管壁的增殖（ki67）、凋亡（Caspase 3）相关指标的m RNA及蛋白水平表达的组间对照结果:Sham组和IA组小鼠颅底血管IGF-1表达的rt-PCR结果显示,IA组IGF-1的m RNA表达水平较Sham组中显著增高（P＜0.001）;增殖相关指标Ki67在IA组中较Sham组升高（P＜0.05）,而OE组中Ki67的RNA表达水平较IA组增加（P＜0.05）,KD组Ki67表达较OE组减少（P＜0.05）。凋亡相关指标Caspase 3在IA组中m RNA表达水平高于Sham组（P＜0.001）,而其在OE组中的表达较IA组下降（P＜0.001）,KD组中Caspase 3表达较OE组增加（P＜0.001）。此外,Ki67和Caspase 3的蛋白水平表达结果与rt-q PCR趋势相同,且组间差异有统计学意义。4.探索小鼠脑血管自噬相关指标的组间表达结果差异发现:IA组自噬相关指标（Beclin-1和LC3-II）的m RNA表达水平较假手术组显著升高（P＜0.01）,OE组中二者的m RNA表达水平较动脉瘤组明显减低（P＜0.001）,而KD组中的表达水平较OE组增高（P＜0.001）。Beclin-1和LC3-II在蛋白水平表达变化与m RNA水平表达趋势相同,组间差异有统计学差异（P＜0.0001）。研究结论:小鼠IAs形成后,脑动脉管壁的VSMCs增殖水平下降,而凋亡、自噬的水平增强:IGF-1可抑制VSMCs的凋亡和自噬、促进VSMCs的增殖,从而抑制脑血管壁的病理性重构,降低小鼠颅底Willis环的成瘤率。第三部分FOXM1对VSMCs中IGF-1转录水平的调控机制及下游通路的探索研究背景:前期研究中,通过体外和在体实验证实了IGF-1对于高WSS诱导的VSMCs凋亡、自噬有抑制作用,且能够促进VSMCs的增殖。通过此调控作用,IGF-1可抑制小鼠脑血管的病理性重构,进而抑制其IAs的形成。然而,IGF-1转录水平的上游调控因子及下游信号通路尚未明确。既往低氧诱导的肺动脉高压模型相关研究中发现,FOXM1与VSMCs的增殖和分裂密切相关,且FOXM1能够靶向调控IGF-1的表达水平。此外,粥样硬化斑块的相关研究中发现,IGF-1可通过PI3K/Akt信号通路来抑制氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox LDL）诱导的VSMCs凋亡。但是,IGF-1在IAs中对于VSMCs的作用是否也受FOXM1调控,且经过PI3K/Akt信号通路调控VSMCs的增殖和凋亡,目前无相关研究报道。因此,为探索IGF-1调控VSMCs增殖和凋亡的上游调控因子,本部分研究通过构建体外ECs-VSMCs共培养模型。对ECs予以梯度WSS刺激,并对VSMCs施以以FOXM1过表达和敲减干预,观察FOXM1对VSMCs的增殖和凋亡的影响,并通过免疫共沉淀技术探索FOXM1是否直接影响IGF-1的转录水平。此外,为探索IGF-1作用于VSMCs的下游信号通路,通过体外模型的WSS刺激,对VSMCs予以IGF-1的过表达和敲减干预,并检测PI3K和Akt的表达,以期明确在动脉瘤发展过程中,IGF-1调控VSMCs增殖和凋亡的下游信号通路。研究方法:依据第一部分的体外实验模型,使用Transwell小室进行ECs-VSMCs共培养,利用Flow chamber构建对ECs的梯度WSS刺激,并使用FOXM1过表达和敲减慢病毒转染VSMCs。按照第一部分得出的WSS数值结果将共培养模型分为正常WSS组（30 dyn/cm2）、高WSS组（50 dyn/cm2）、高WSS+FOXM1空白病毒组（NC组）,高WSS+FOXM1过表达组（FOXM1 OE组）和高WSS+FOXM1敲减组（FOXM1KD组）。使用流式细胞术检测VSMCs组间凋亡差异,应用rt-q PCR及WB检测FOXM1对高WSS作用下VSMCs增殖和凋亡的影响,并通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）技术分析FOXM1对IGF-1转录水平的调控作用。此外,进一步验证IGF-1作用于VSMCs的下游信号通路,使用IGF-1过表达和敲减慢病毒转染VSMCs,构建共培养模型后给予正常WSS和高WSS刺激,将共培养细胞分为正常WSS组（30 dyn/cm2）、高WSS组（50 dyn/cm2）、高WSS+IGF-1空白病毒组（NC组）,高WSS+IGF-1过表达组（IGF-1 OE组）和高WSS+IGF-1敲减组（IGF-1 KD组）。应用rt-q PCR及WB实验检测VSMCs中PI3K和Akt在m RNA和蛋白水平的表达情况。研究结果:1.细胞流式凋亡结果显示:VSMCs在高WSS组中的凋亡比例较正常WSS组增加（40.29%vs.10.99%）,而FOXM1 OE组VSMCs凋亡比例较NC病毒组降低（11.66%vs.39.55%）。2.CCK8增殖实验结果显示:WSS升高后,VSMCs增殖作用减弱。在FOXM1 OE组中,VSMCs增殖水平较NC组增高（p＜0.05）,且细胞增殖水平随时间进一步增强（p＜0.05）。3.VSMCs的细胞增殖（ki67）、凋亡（Caspase 3）相关指标在m RNA和蛋白表达水平结果显示:高WSS组较正常WSS组的Caspase 3在m RNA表达水平明显升高（p＜0.001）,在FOXM1 OE组中,Caspase 3表达水平较NC组下降（p＜0.001）,而在FOXM1 KD组中,可见Caspase 3表达水平较OE组上升（p＜0.001）。FOXM1OE组中,Ki67在m RNA水平的表达较NC组增高（p＜0.001）。与此同时,Caspase3和Ki67在蛋白水平的表达趋势与rt-q PCR结果有一致性。4.染色质免疫共沉淀（Ch IP）提示,当FOXM1过表达后,IGF-1的启动子转录水平较NC组升高,而当FOXM1敲减后,IGF-1启动子转录水平下降。5.IGF-1下游作用通路的rt-q PCR和WB检测结果提示:当WSS增高后,PI3K和AKT在m RNA水平的表达量下降（p＜0.001）,当IGF-1过表达后,PI3K和AKT在m RNA的表达水平较NC组增高（p＜0.001）,而在IGF-1 KD组中,PI3K和AKT在m RNA的表达水平均较OE组下降（p＜0.001）。PI3K和AKT在蛋白水平表达量的组间对照结果和rt-q PCR组间趋势有一致性。研究结论:FOXM1正向调控IGF-1,并促进了WSS升高后VSMCs的增殖,抑制其凋亡。此外,IGF-1经PI3K/Akt作用通路促进VSMCs的增殖,并抑制其凋亡。