一、课题背景结直肠癌在全球癌症发病率中排名第三,是与癌症相关死亡的第二大原因。目前,局部进展期直肠癌患者实行新辅助放疗后手术的多学科治疗模式已成为新的治疗标准。这种方法可改善肿瘤预后,包括局部控制和长期生存。尽管如此,具有放射抵抗性的癌细胞亚群仍可能在经历此类治疗模式后存活下来。另外,在放疗期间,癌细胞本身也会逐渐衍生出放射抵抗的亚群。这一类癌细胞若成功定植在局部或远处器官则可导致局部复发和远处转移,从而导致临床预后不良。因此,解决临床上直肠癌患者的放射抵抗问题对于提高其整体预后是非常重要的。肿瘤放射治疗的主要机制是诱导癌细胞产生大量DNA损伤,而癌细胞自身的DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）决定了癌细胞的放射敏感性。DDR是细胞所具备的一套完善的DNA修复体系,癌细胞放疗后DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤类型,常导致细胞凋亡、自噬以及细胞周期阻滞。然而,DDR在此时即可发挥作用,且癌细胞具有比正常细胞更强的DNA修复能力,因此它可能在放射治疗下存活,从而促进整体癌组织出现放射抵抗的现象。DSB有两种主要的修复途径,分别是非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）。目前,临床上已开发若干阻断这两条修复途径的药物,但是针对DDR的临床应用尚处于起步阶段。因此,识别可能参与DDR的新分子也可为放射增敏提供新的靶点。PRDM家族是锌指序列特异性的染色质因子,在胚胎发育和细胞分化决定中起重要作用。在所有PRDM家族成员中,PRDM15可维持小鼠胚胎干细胞的幼稚状态;PRDM15通过直接促进Rspo1和Spry1的表达调控WNT和MAPK-ERK通路的信号转导;在B细胞淋巴瘤的研究中,PRDM15可调节PI-3K/AKT/m TOR通路和糖酵解活性的转录程序;敲除PRDM15可引起淋巴瘤细胞的代谢危机和选择性死亡;此外,PRDM15调控NOTCH和WNT/PCP通路上关键效应因子的转录,以保持胚胎发育中的早期中线结构。尽管PRDM15在干细胞生物学和胚胎早期发育过程中的作用有了较为详尽的描述,但它在癌症领域中的研究尚未见明确报导。在本研究中,我们发现PRDM15可通过和DNA-PK相互作用促进NHEJ通路进行DNA损伤修复,调节直肠癌的放疗抵抗性。我们发现在肿瘤细胞和患者组织来源的异种移植模型（CDX和PDX）中敲低PRDM15可增加模型的放疗敏感性。此外,在接受新辅助放化疗的局部进展期直肠癌患者中,PRDM15的高表达与患者的放射抵抗和临床预后不良相关。本研究为直肠癌的放射治疗提供了新的思路。二、研究内容及方法（一）PRDM15调控结直肠癌细胞的DNA损伤修复能力选取不同来源的结直肠癌细胞系,如HCT116、HT29和Wi Dr,分别于细胞接受电离辐射后0 h（未加干预的空白对照）、0.5 h、4 h、8 h和12 h提取各个时间点的细胞蛋白质,通过Western Blot技术检测HCT116、HT29和Wi Dr细胞在应答电离辐射时PRDM15可能出现的变化。为了探讨PRDM15在细胞应对DNA损伤中的普遍规律,我们还使用了临床上常用的化疗药物——依托泊苷（ETO）、喜树碱（CPT）和奥拉帕尼（Olaparib）来诱导DNA损伤,检测技术同电离辐射组;在转录水平层面,我们提取了细胞接受辐射后0 h（空白对照）、4 h、8 h、12 h和24 h的RNA,通过RNA反转录技术和RT-PCR技术检测HCT116和HT29细胞在应答电离辐射时PRDM15的转录水平变化;在PRDM15的亚细胞定位方面,我们进行了免疫荧光技术检测,使用共聚焦显微镜确认其在细胞核内空间上的变化。初步探索发现PRDM15可能参与到DDR后,我们构建了PRDM15敲低和过表达的HCT116细胞。利用PRDM15 NC、KD和OE细胞进行了细胞增殖实验、克隆形成率实验、细胞凋亡检测和细胞周期检测等多种实验,以证实PRDM15促进结直肠癌细胞对辐射的抵抗。（二）PRDM15促进DNA损伤NHEJ修复通路调控结直肠癌放疗敏感性在PRDM15 NC和PRDM15 KD的HCT116接受辐射后的0 h（未加干预的空白对照）、0.5 h、12 h和24h,我们通过免疫荧光技术检测了细胞中γ-H2AX和53BP1的foci形成情况,用以评估PRDM15敲低后对结直肠癌细胞中DNA损伤修复的影响。为了进一步探究PRDM15对结直肠癌细胞DDR通路的具体影响,我们分别对PRDM15 NC、PRDM15 KD和PRDM15 OE的结直肠癌细胞采用电离辐射（8Gy）的处理。分别在干预后的0 h（未加干预的空白对照）、0.5 h、4 h、8 h和12h时间点,提取细胞蛋白,通过Western Blot技术检测敲低或过表达PRDM15后对HR和NHEJ信号通路上具体分子的影响。另外,我们使用了DDR通路上游激酶的抑制剂来进一步探索PRDM15参与DDR的方式。我们选取了DDR通路上游激酶DNA-PK的抑制剂——NU7441、ATM抑制剂——KU55933以及ATR抑制剂——VE821预处理细胞2 h,采用8Gy辐射剂量处理HCT116细胞,选取处理后0 h（抑制剂干预但辐射未加干预的对照）、0.5 h和8 h提取细胞蛋白质,通过Western Blot技术检测DNA损伤后0.5 h和8 h后,DDR通路上游激酶的抑制剂对PRDM15表达水平的影响。最后,我们利用HCT116细胞的蛋白裂解液进行了co-IP实验,探讨了PRDM15与DNA-PK的相互作用情况,对以上研究内容所提出的假设加以验证。（三）PRDM15对动物直肠癌放疗模型放射敏感性的影响及临床分析构建裸鼠直肠癌CDX放疗模型和裸鼠直肠癌PDX放疗模型,通过瘤体生长曲线、肿瘤大体解剖、病理切片、免疫组化和免疫荧光染色等方式,从体内层面明确PRDM15敲低对直肠癌放疗的增敏效应。此外,我们通过TCGA数据库分析直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中PRDM15的表达差异,并且收集我科临床直肠癌患者的术后样本,将其制成组织芯片进行PRDM15的免疫组化检测,探究PRDM15的表达量和临床肿瘤退缩分级（TRG）之间的关系。最后根据PRDM15的表达程度将组织芯片来源的患者分为PRDM15高表达和低表达组,回顾临床随访资料后绘制这些患者的Kaplan-Meier曲线,更进一步从临床层面明确PRDM15的放疗抵抗作用。三、研究结果（一）PRDM15调控结直肠癌细胞的DNA损伤修复能力和放射敏感性;经过8 Gy辐射后,PRDM15在不同结直肠癌细胞系中的表达均有显著升高;在转录层面,辐射后的结直肠癌细胞中PRDM15的m RNA水平也升高;经过免疫荧光共定位检测,我们发现PRDM15定位于细胞核,于DNA损伤后在核内形成清晰的foci,且与γ-H2AX发生共定位。构建敲低和过表达PRDM15的HCT116细胞后,通过细胞增殖实验、克隆形成率实验、细胞凋亡和细胞周期检测等实验证实:敲低PRDM15可以降低辐射后结直肠癌细胞的存活率;敲低PRDM15可以降低结直肠癌细胞的增殖率;敲低PRDM15可以增加辐射后结直肠癌细胞的细胞凋亡率;敲低PRDM15使辐射后结直肠癌细胞出现G2/M期的抑制。（二）PRDM15与DNA-PK相互作用调节NHEJ修复途径;通过免疫荧光技术检测辐射后HCT116细胞中γ-H2AX和53BP1的foci数目,我们发现敲低PRDM15显著抑制辐射后结直肠癌细胞的DNA损伤修复,PRDM15KD细胞接受辐射后残留的γ-H2AX和53BP1的foci数目多于PRDM15 NC细胞。进一步通过Western Blot检测证实,敲低PRDM15抑制了DNA损伤修复的NHEJ通路。为了进一步验证这一结论,我们利用DNA损伤修复通路的上游激酶抑制剂处理细胞,我们发现只有DNA-PK抑制剂——NU7441作用后,PRDM15在细胞辐射后的表达降低了;说明PRDM15极有可能通过与DNA-PK相互作用介导NHEJ修复通路。最后我们通过免疫共沉淀实验证实了PRDM15确实与DNA-PK存在相互作用关系。（三）PRDM15对动物直肠癌放疗模型放射敏感性的影响及临床分析成功构建裸鼠直肠癌CDX及PDX模型后,我们对其进行辐射干预,我们发现敲低PRDM15对裸鼠直肠癌CDX和PDX模型有明显的放疗增敏效果;此外通过免疫组化染色的技术,我们证实敲低PRDM15显著抑制了放疗后直肠癌细胞的增殖并可促进其损伤和凋亡。另一方面通过临床组织芯片的免疫组化检测,我们发现PRDM15的表达水平与临床患者放疗后的TRG有高度相关性。基于以上认识我们将组织芯片来源的患者分为PRDM15高表达和低表达两组,结果证实PRDM15高表达与临床患者放疗抵抗和预后不良相关。四、结论本研究发现的直肠癌放疗抵抗新靶点PRDM15,其可调节结直肠癌细胞的DNA损伤修复能力。PRDM15的作用机制是通过与DNA-PK相互作用参与介导NHEJ修复途径,从而调控直肠癌细胞的放疗抵抗性。在体内实验中,敲低PRDM15可提高裸鼠直肠癌PDX模型的放疗敏感性。在临床层面,PRDM15高表达与直肠癌放疗后肿瘤退缩分级差以及预后不良相关。