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研究目的创伤后骨性关节炎（PTOA,post traumatic osteoarthritis）早期软骨下骨中过度激活的破骨细胞（OC,Osteoclast）引起异常骨重建导致了关节软骨的退变和OA的进展,但机制尚不清楚。本研究通过淋巴细胞浆蛋白1（Lcp1,Lymphocyte Cytosolic Protein1）基因敲除动物的体内实验,探究抑制软骨下骨破骨细胞异常激活是否可以延缓PTOA进展;观察PTOA早期软骨下骨氧分压的变化;探究PTOA早期软骨下骨破骨细胞激活导致缺氧环境改变引起软骨退变的可能机制;探究缺氧诱导因子1α（HIF-1α,hypoxia-inducible factor-1alpha）在PTOA软骨退变中的作用;验证药物抑制Lcp1基因编码的L型网素蛋白（LPL,L-Plastin）可以减少软骨下破骨细胞异常激活,延缓骨性关节炎进展。研究方法Lcp1敲除小鼠和野生型（WT,Wild Type）小鼠采用前交叉韧带横断法（ACLT,Anterior Cruciate Ligament Transection）构建PTOA模型。通过微型电子计算机断层扫描（Micro-CT,micro Computed Tomography）对比两种小鼠软骨下骨的骨体积/总体积（BV/TV,bone volume/tissue volume）和软骨下骨板厚度（SBP.th,Subchondral Bone Plate Thickness）,通过Micro-CT血管造影扫描分析小鼠软骨下骨血管体积。小鼠膝关节组织固定,脱钙后制备5μm或30μm厚矢状面石蜡或冰冻切片。采用以下组织学染色方法对比两种小鼠软骨及软骨下骨的改变:1.苏木精伊红染色（HE,Hematoxylin and Eosin）计算关节透明软骨与钙化软骨比例;2.番红固绿染色通过国际骨性关节炎研究学会（OARSI,Osteoarthritis Research Society International）软骨损伤评级评估膝关节软骨退变程度;3.抗酒石酸性磷酸酶（TRAP,Tartrate Resistant Acid Phosphatase）染色计数软骨下骨破骨细胞数量。采用以下软骨合成、分解代谢和矿化标志物的免疫组化染色对比两组小鼠软骨退变情况:1.二型胶原（COLⅡ,CollagenⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN,Aggrecan）;2.基质金属蛋白酶13（MMP13,Matrix metalloproteinases13）和一种具有血栓反应蛋白基序的解凝素和金属蛋白酶5（ADAMTS5,Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 5）;3.十型胶原（COLⅩ,CollagenⅩ）。采用以下免疫荧光染色对比两组小鼠软骨及软骨下骨血管、神经侵入情况:1.血小板-内皮细胞粘附分子（CD31,Platelet endothelial cell adhesion molecule-1）及内皮粘蛋白（Emcn,Endomucin）;2.缺氧探针哌莫硝唑;3.轴突生长导向因子1（NTN1,NETRIN-1）;4.降钙素基因相关肽（CGRP,Calcitonin gene related peptide）。采用18F-硝基咪唑(18F-F MISO,18F-fluoromisonidazole)放射性缺氧探针,通过微型正电子发射计算机断层显像（Micro-PETCT,micro positron emission tomograph）观察活体小鼠膝关节氧气分布情况,计算健侧与患侧最大标准吸取值（SUV,standard uptake value）的比值。采用von Frey test观察小鼠膝关节疼痛情况。人膝关节软组织样本取自两例全膝关节置换患者,制备成5μm石蜡切片。采用免疫荧光染色对比小鼠及人膝关节正常软骨和OA软骨间HIF-1α的表达差异。采用差异基因富集、京都基因与基因组百科全书（KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和基因本体论（GO,Gene Ontology）富集分析、差异基因集变异分析（GSVA,Gene Set Variation Analysis）重新分析GES104782人膝关节软骨单细胞测序数据,筛选受HIF-1α调控且参与OA进展的软骨细胞。在Lcp1敲除小鼠中应用Hif1a基因敲低腺相关病毒（AAV,adeno-associated virus）及WT小鼠中应用HIF-1α蛋白稳定剂二甲氧乙二酰甘氨酸（DMOG,Dimethyloxallyl Glycine）,观察上述软骨及软骨下骨变化指标,验证软骨下骨破骨激活介导的血管化通过氧气降解HIF-1α导致PTOA进展。通过在野生型PTOA模型小鼠中应用千层纸素A（Oxy A,Oroxylin A）,观察上述软骨及软骨下骨变化指标,验证靶向软骨下骨破骨细胞中的LPL蛋白可以延缓骨性关节炎进展。研究结果我们发现正常软骨及软骨下骨中极少出现破骨细胞及LPL蛋白。LPL蛋白在PTOA早期的软骨下骨中一过性出现,时空定位与破骨细胞一致。与WT小鼠相比,Lcp1-/-小鼠的软骨退变减轻:1.透明软骨与钙化软骨比例增加;2.OARSI软骨退变等级下降;3.软骨合成代谢产物增加;4.软骨分解代谢产物减少。Lcp1-/-小鼠的软骨下骨的骨重建减少,造模后2周时软骨下骨骨量增加。Lcp1-/-小鼠的软骨下骨血管侵入减少:1.血管造影显示软骨下骨血管增加趋势减少;2.H型血管增加趋势减少。Lcp1-/-小鼠软骨下骨感觉神经侵入减少且疼痛减轻:1.神经诱导因子NTN1表达减少,2.CGRP阳性神经纤维减少,3.小鼠von Frey test针刺实验缩爪阈值增加。18F-FMISO PETCT活体扫描和缺氧探针荧光结果显示PTOA早期软骨下骨及软骨缺氧环境被改变,Lcp1的敲除阻碍了破骨细胞介导的血管生成,抑制软骨下骨的氧分压水平升高,维持了关节的缺氧微环境。氧气介导的HIF-1α降解在OA的进展中发挥重要作用。我们通过单细胞测序分析发现一群受HIF-1α蛋白调控的与OA发展相关的肥大软骨细胞亚群,即OA相关肥大软骨细胞（OA-HTC OA associated hypertrophic chondrocyte）。GSVA分析显示该群细胞的OA信号通路激活水平最高同时HIF-1信号通路激活水平最低。OA-HTC是软骨中分泌MMP13等基质降解酶和COLⅩ等钙化软骨基质胶原的主要来源,通过软骨内成骨导致钙化软骨厚度增加。通过AAV敲低Hif1a可以废除Lcp1敲除对软骨的保护作用,但并不影响Lcp1敲除对软骨下骨的保护。通过脯氨酸羟化酶2（PHD2,Proline hydroxylase 2）的抑制剂DOMG稳定HIF-1α,可以减缓软骨退变但无法抑制软骨下骨的异常骨重建。最后我们发现LPL蛋白的抑制剂Oxy A可以减弱软骨下骨骨重建,延缓软骨退变、减少软骨下骨神经侵入和减轻小鼠疼痛。结论1.Lcp1基因敲除可以抑制PTOA早期软骨下骨破骨细胞激活,延缓骨性关节炎进展。2.PTOA早期软骨下骨破骨细胞激活介导的H型血管形成使p O2水平升高。3.升高的p O2水平降解软骨细胞中的HIF-1α,导致软骨细胞肥大化并进行软骨内成骨使钙化软骨厚度增加。4.HIF-1α是PTOA软骨下骨异常骨重建影响软骨退变的下游关键分子,是潜在的治疗靶点。5.LPL蛋白是抑制PTOA早期软骨下骨中破骨细胞激活的治疗靶点,Oxy A可以延缓PTOA进展是OA的潜在疾病修饰药物（DMOADs,Disease-Modifying OA Drugs）。