全文分为二部分： 第一部分雌激素和壬基酚诱导免疫细胞凋亡机制的研究 目的：探讨雌激素诱导胸腺萎缩和细胞凋亡的机制；观察壬基酚是否具有相同效应；为进一步了解壬基酚的毒性，进而限制其在工业中的应用提供依据。 方法：体内用不同浓度的雌激素（0.01，0.1，1，10ng/kg/day）和壬基酚（0，125，250，mg/kg/day）分别灌胃大鼠。体外用不同浓度壬基酚（0.1，1，10ppm）分别处理培养的胸腺和Jurkat细胞。用多种方法来检测细胞凋亡：HE染色观察凋亡形态学改变；Hoechst染色和DNA阶梯状电泳分析DNA断裂；PI染色后经流式细胞仪决定亚二倍体峰-即凋亡峰；TUNEL法测定细胞凋亡比例；AnnexinV/P1分析凋亡发生后生物学改变及凋亡细胞比例。应用RT-PCR和流式细胞术检测凋亡时细胞中Fas/FasL mRNA和蛋白质水平的变化；JC-1染色后用荧光显微镜和流式细胞仪分析线粒体膜电位；流式细胞仪测定Caspase3和8的活性；分别应用Caspase3特异性阻断剂z-DEVD-fmk和Caspase8特异性阻断剂IFTD-fmk与壬基酚共同处理胸腺和Jurkat细胞，分析细胞凋亡是否逆转。 结果：雌激素和壬基酚在体内都能通过Fas/FasL途径诱导胸腺萎缩和细胞凋亡：HE染色表明胸腺皮质／髓质之比减小，并且有部分皮质被脂肪组织替代，细胞染色质浓缩而呈现着色会加深；用TUNEL法检测时，壬基酚和雌激素组胸腺细胞中深染的细胞即为凋亡细胞数目和比例比对照组明显增多；雌激素和壬基酚组Fas/FasL mRNA的表达比对照组增加。壬基酚在体外通过Fas/FasL、线粒体和Caspase3介导胸腺细胞凋亡：壬基酚明显抑制胸腺细胞增殖；DNA电泳出现特征性“阶梯状”条带；Hoechst 33258染色后，绝大多数细胞呈现为高度浓缩状（染色后比较亮或深）；PI染色后观察细胞周期分布图，可以见到在正常二倍体峰之前的“亚二倍体”峰，即细胞凋亡峰；Annexin V/PI双染法检测后，处理组Annexinv阳性，PI阴性细胞（凋亡细胞）比率比对照组明显增加；与凋亡发生同步，Fas蛋白的变化与mRNA趋势一致，即壬基酚使Fas表达增加；FasL mRNA和其蛋白的表达在壬基酚处理后，随着时间的增加而增加；Jc-1染色检测线粒体膜电位后，在荧光显微镜下，随着壬基酚剂量的增加，发桔红色荧光的细胞逐渐减少，发绿色荧光的细胞逐渐增多，而对照组变化不明显。流式细胞仪定量分析发现壬基酚剂量和时间依赖性增加发绿色荧光的细胞数目，而对照组变化不明显。Caspase8的变化在壬基酚处理后的变化没有统计学意义，但是Caspase3的变化与壬基酚诱导胸腺细胞凋亡的效应一致；Caspase3特异性阻断剂z-DEVID-fmk能逆转壬基酚诱导的细胞凋亡，而caspase8特异性阻断剂IFTD-fmk没有此效应。壬基酚通过活化Caspase8诱导Iurkat细胞凋亡：MTT检测表明壬基酚明显降低Jurkat细胞活力；三种壬基酚组都出现凋亡特征性DNA Ladder，而对照组没有此凋亡条带；Hoechst 33258染色显示壬基酚处理后，荧光显微镜观察到视野内绝大多数细胞呈现为高度浓缩状（凋亡状态）；PI染色后壬基酚处理组Jurkat细胞出现明显凋亡峰，且比例增加；Annexin V/PI双染后，也发现凋亡细胞数目和比例增加；与凋亡效应相对应，细胞caspase8活性也相应增加；Caspase 8特异性阻断剂可以阻断壬基酚诱导的凋亡。 结论：证明雌激素及其环境类似物－壬基酚能影响免疫系统；揭示了雌激素和壬基酚在体内外诱导胸腺细胞凋亡的分子机制；指出壬基酚诱导胸腺和Jurkat细胞凋亡的机制不同；为临床上合理应用雌激素替代疗法和限制环境中雌激素类似物在工业中的使用提供了依据。 第二部分人肿瘤坏死因子相关凋亡受体克隆、表达纯化 目的：克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡受体（TRAIL）可溶性片段，构建其原核表达质粒，诱导此蛋白的高效表达，纯化此重组蛋白并检测其生物学活性，为进一步研究TRAIL的生物学特性和功能而大量制备hsTRAIL蛋白提供依据。 方法：用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞；用Trizol抽提细胞总RNA；并应用巢式PCR方法扩增hsTRAIL；将扩增的产物直接克隆至T载体；经PCR、酶切和测序鉴定重组子的正确性；然后再亚克隆至原核表达载体pET28a，构建重组hsTRAIL原核表达质粒pET28a／hsTRAIL；经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导此质粒高效表达；通过透析和凝胶过滤法纯化了此包涵体蛋白；筛选出适合鉴定重组表达蛋白的生物学活性的细胞株；最后，用纯化的重组表达蛋白作用于该细胞株，通过检测细胞活力，亚二倍体峰，和线粒体膜电位来观察其诱导凋亡的生物学活性。 结果：巢式PCR扩增产物电泳后，在500bp处有一条清晰的条带，其大小与目的基因片段的理论值完全一致。选取TA克隆后转化的白斑，PCR和酶切鉴定后，在预期目的基因大小处有条带，然后将此菌落扩增后测序，测序结果和GeneBank原始记录（NM003810）有一个碱基的差异，即920位的T（NM00381 0为G）。核对该基因的mi sc feature，发现与dbsNP 1131532报道一致，并且编码蛋白无差异；成功构建重组hsTRAIL原核表达质粒pET28a／hsTRAIL；PCR和酶切鉴定正确；成功诱导了此重组蛋白的表达；确定此表达蛋白分布在包涵体；使此包涵体蛋白得到纯化；RT-PCR筛选出Jurkat细胞含有TRAIL特异性受体DR4和DR5；重组的hsTRAIL抑制表达TRAIL受体的白血病细胞株-Jurkat细胞增殖；用PI染色后分析，可在二倍体G0／G1峰前出现一个亚二倍体峰即AP峰；荧光显微镜定性和流式细胞仪定量检测JC-1染色的结果都表明重组的hsTRAIL可使Jurkat细胞线粒体膜电位明显下降，并且使细胞发生凋亡；证明了我们克隆、表达和纯化的人可溶性TRAIL基因片段具有杀伤肿瘤细胞的活力，以此方法产生的TRAIL可满足进一步研究的需要。 结论：这些结果都证明我们构建、表达和纯化的人可溶性TRAIL片段具有生物学活性，以此方式获得高效表达的TRAIL蛋白可以为进一步研究TRAIL生物学特性和作用机制提供基础。