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研究背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中80%以上为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),其中又以肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)最常见;由于早期特异性症状较少,经常会导致延误诊治;肺癌早期切除率仅为20%左右,术后远期复发率为50%,5年中位生存率仅为10%左右。LncRNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个碱基且缺乏蛋白质编码能力的RNA,具有与mRNA相似的结构特征;lncRNA是与肺癌发生发展密切相关的基因治疗靶点,可以作为早期发现肺癌,判断预后的标志物。微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子,通过与mRNA的3’-末端非翻译区(3 ’-Untranslated Regions,3 ’-UTR)特异性结合,引起mRNA降解或翻译抑制。LncRNA发挥功能涉及多基因调控网络,最常见的作用机制为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制,lncRNA与mRNA竞争结合miRNA,导致miRNA的降解,从而减弱了 miRNA对mRNA的调控,这种竞争性结合miRNA的作用又被叫做miRNA海绵作用。我们通过大数据筛选LUAD相关lncRNA,发现LINC02535在LUAD中表达显著上调,且尚未见相关报道,其在LUAD中的作用和相关分子机制并不清楚。在线数据库提示miR-30a-5p为LINC02535结合靶点,miR-30a-5p被证实为在LUAD表达下调,起到抑癌基因作用,但是其在LUAD中的相关分子机制尚未完全清楚。我们通过生信分析预测糖基化转移酶3(GalNAc Transferase 3,GALNT3)为miR-30a-5p下游靶基因,GALNT3属于糖基化转移酶家族;糖基化是在糖基化转移酶的控制下,蛋白质或脂质附加上糖类的过程;糖基化调节着肿瘤的增殖、侵袭、转移、多药耐药及免疫逃逸,在肿瘤的诊断、治疗等方面发挥着重要作用;GALNT3在LUAD中的作用及相关分子机制尚未见相关报道。大数据预测粘蛋白1(Mucin 1,MUC1)为GALNT3糖基化靶点,MUC1是由muc1基因表达的一种高糖基化、高分子量蛋白,可促进LUAD的增殖与转移;MUC1是一种异源二聚体跨膜糖蛋白,由氮端亚单位(MUC1-N)和碳端亚单位(MUC1-C)组成。MUC1-N受GALNT3调控,并且通过MUC1-C调节下游信号转导。研究目的:探究LINC02535对LUAD细胞的增殖和转移的影响及相关作用机制。研究方法:1.利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中基因表达数据筛选LUAD组织(n=54)与癌旁组织(n=497)差异表达的lncRNA,确定LINC0253 5 为研究对象,运用荧光定量 PCR(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR)实验检测LINC02535 mRNA在40例LUAD患者癌组织和癌旁组织及支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和3株LUAD细胞系(A549、H1299、H1650)中的表达水平。2.运用siRNA-LINC02535转染A549和H1299细胞干扰LINC02535表达,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)、克隆形成实验检测细胞增殖变化,应用Transwell实验观察细胞迁移和侵袭变化。3.通过qRT-PCR实验测定miR-30a-5p在BEAS-2B和A549、H1299、H1650中的mRNA表达水平,利用qRT-PCR、RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RIP)、双荧光素酶报告基因实验探究LINC02535对miR-30a-5p的调控和相关机制。4.利用qRT-PCR、蛋白免疫印记(western blot)、双荧光素酶报告基因实验探究miR-30a-5p对GALNT3的调控和作用机制。5.利用qRT-PCR实验检测GALNT3在40例LUAD患者癌组织和癌旁组织的mRNA表达水平,运用qRT-PCR、western blot实验检测BEAS-2B和A549、H1299、H1650中的mRNA和蛋白表达水平。6.运用siRNA-GALNT3转染A549和H1299细胞干扰GALNT3表达,通过CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖变化,应用Transwell实验观察细胞迁移和侵袭变化。7.运用生物信息学分析和长柔毛野豌豆外源凝集素(Vicia villosa lectin,VVA)拉下实验验证GALNT3的糖基化靶点,利用western blot实验检测GALNT3和MUC1 的下游信号通路。8.运用shRNA-LINC02535和miR-30a-5p inhibtor构建不同LINC02535和miR-30a-5p表达状态的A549和H1299细胞,利用qRT-PCR、western blot实验检测GALNT3的变化,通过CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖变化,应用Transwell实验观察细胞迁移和侵袭变化。9.建立裸鼠移植瘤模型在体内验证LINC02535对A549细胞增殖的影响。研究结果:1.TCGA数据显示LINC02535在LUAD组织中表达显著高于正常肺组织(logFC=4.38,p<0.05)(FC=Fold change),LINC02535 mRNA在40例LUAD患者癌组织中表达较癌旁组织明显升高(p<0.05),在LUAD细胞系(A549、H1299)中较支气管上皮细胞系(BEAS-2B)显著高表达(p<0.05)。在A549和H1299细胞干扰LINC02535导致细胞增殖、迁移和侵袭能力明显减弱。2.在A549和H1299细胞干扰LINC02535可显著增加miR-30a-5p表达,RIP和双荧光素酶报告基因实验结果证实LINC02535能够结合miR-30a-5p(p<0.05)。miR-30a-5p在A549、H1299细胞中较BEAS-2B细胞显著低表达(p<0.05);过表达miR-30a-5p可以显著下调GALNT3表达,干扰miR-30a-5p可以显著上调GALNT3表达(p<0.(05);双荧光素酶报告基因实验结果证实miR-30a-5p能够结合GALNT3的3’-UTR(p<0.05)。3.GALNT3 mRNA在40例LUAD患者癌组织中表达较癌旁组织明显升高(p<0.05),GALNT3 mRNA和蛋白在A549、H1299细胞中较BEAS-2B细胞显著高表达(p<0.05);在A549和H1299细胞干扰GALNT3导致细胞增殖、迁移和侵袭能力明显减弱。GALNT3通过增强MUC1糖基化激活NF-κB信号通路。4.在A549和H1299细胞干扰LINC02535的基础上干扰miR-30a-5p可以部分逆转下调LINC02535引起的GALNT3表达下降和细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱(p<0.05)。在裸鼠皮下成瘤实验中,LINC02535干扰组的肿瘤体积及重量均较对照组显著减小(p<0.05)。结论:1.LINC02535可在体外促进A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭;LINC02535可在体内促进A549细胞增殖。2.GALNT3是miR-30a-5p的下游靶点,可以促进MUC1的糖基化进而激活NF-κB信号转导通路促进A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭。3.LINC02535通过抑制miR-30a-5p,进一步上调GALNT3表达,促进A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭。