目的:Mineral dust-induced gene（mdig）能够抑制A549细胞的侵袭和转移,促进多种细胞的增殖。本研究的主要目的是探索mdig抑制细胞侵袭和转移,及促进细胞增殖的分子机制。研究方法:研究的第一部分:研究mdig抑制细胞侵袭和转移的分子机制。实验中使用慢病毒载体分别构建A549细胞mdig沉默和过表达稳定转染细胞系以及人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）mdig过表达稳定转染细胞系。稳定转染的细胞培养、传代4次以后,对比×100明场和GFP荧光场,GFP阳性细胞百分比观察细胞的转染效率,在×400 GFP荧光场,对比转染后细胞形态的变化。使用western blot方法验证mdig蛋白的沉默和过表达结果。利用Transwell小室实验检测各A549实验组细胞的侵袭能力,Transwell小室和划痕实验检测各A549实验组细胞的转移能力。然后再利用western blot方法分别检测GSK-3β/β-catenin信号通路的主要生化指标（P-GSK-3β、β-catenin、activeβ-catenin）和其下游调控EMT的转录因子（slug、snail、ZEB1）的蛋白修饰水平和表达量的变化,以及EMT的分子标志物（E-cadherin、claudin-1、ZO-1、N-cadherin、vimentin）以及细胞和细胞与细胞外基质间的紧密连接蛋白（integrinβ1、integrinβ4）表达量的变化。研究的第二部分:研究mdig促进细胞增殖的分子机制。实验中使用慢病毒载体分别构建A549细胞mdig沉默和过表达稳定转染细胞系以及HUVEC细胞mdig过表达稳定转染细胞系,并使用特异性的PI3K信号通路抑制剂（LY294002）处理A549细胞和HUVEC细胞mdig过表达稳定转染细胞。使用EdU荧光成像法检测各实验组细胞的EdU阳性细胞百分比,即各实验组细胞的增殖能力。再利用western blot方法分别检测各实验组细胞PI3K/Akt（P-pten、P-PDK1、Akt、P-Akt（Thr308））和mTORC2/Akt（mTOR、Rictor、GβL、Akt、P-Akt（Ser473））信号通路主要生化指标和其下游调控的细胞周期相关蛋白(P18INK4C、P19INK4D、CDK2、CDK6)的蛋白修饰水平和表达量变化。结果:成功构建稳定转染的细胞系:使用相应的慢病毒感染A549细胞和HUVEC细胞,常规培养传4代后,使用倒置荧光显微镜分别在明场×100,和同一个视野GFP荧光场×100、×400拍照观察,可见被转染的细胞状态良好,转染效率高。在A549细胞mdig沉默实验中,与LV-con组比较,可见LV-mdig-RNAi 1组和LV-mdig-RNAi 2组mdig蛋白表达量较正常A549组和LV-con组明显下降。而在A549细胞mdig过表达实验中,可见LV-mdig组的mdig蛋白表达量较正常A549组和vector组明显上调。HUVEC细胞mdig过表达实验中,可见LV-mdig组的mdig蛋白表达量较正常HUVEC组和vector组明显上调。Mdig对于细胞侵袭和转移的调控:mdig沉默A549细胞的细胞形态由A549细胞典型的鹅卵状向类成纤维细胞的细长主轴形状改变,而mdig过表达A549细胞的细胞形态由鹅卵状向类圆形改变。Transwell侵袭实验结果显示,与正常A549组和对照组比较,mdig过表达A549细胞组的穿基质胶膜细胞数明显减少,而mdig沉默A549细胞组的穿基质胶膜细胞数却明显增加;迁移实验的实验结果与上述结果完全一致。为了进一步验证mdig对A549细胞的转移能力的影响,本研究采用划痕实验进行验证,结果发现,与对照组比较,mdig过表达A549细胞组划痕愈合速度明显减慢,而mdig沉默A549细胞组划痕愈合速度明显增快。Western blot方法分别检测GSK-3β/β-catenin信号通路主要生化指标和其下游调控EMT转录因子的蛋白修饰水平和表达量的变化,结果发现mdig能够抑制GSK-3β（P-Ser9-GSK-3β）的磷酸化,进而促进β-catenin（P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin）的磷酸化,使得活化形式的β-catenin（非磷酸化形式）减少,细胞核内移的β-catenin减少导致其下游EMT发生的直接促进因子slug、snail、ZEB1的表达量降低。而且mdig能够上调上皮细胞标志物（E-cadherin、claudin-1、ZO-1）以及细胞与细胞和细胞外基质间紧密连接的蛋白（integrinβ1、integrinβ4）的表达,同时下调间质细胞标志物（N-cadherin、vimentin）的表达。在A549细胞中过表达mdig能够抑制细胞的侵袭和转移能力,沉默mdig时其侵袭和转移的能力得到了提高,同时发现mdig下调A549细胞侵袭和转移能力的分子机制主要是通过抑制GSK-3β（P-Ser9-GSK-3β）的磷酸化,进而促进β-catenin（P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin）的磷酸化,使得β-catenin处于不稳定状态,阻止β-catenin细胞核内转移,进而导致其下游的转录因子slug、snail、ZEB1表达下调,从而导致上皮细胞标志物及促进细胞间紧密连接的蛋白分子E-cadherin、claudin-1、ZO-1、integrinβ1、integrinβ4表达升高,间质细胞的标志物N-cadherin、vimentin表达降低。实验同时使用了HUVEC细胞对上述分子机制做了验证,并得到了相同的结果。Mdig对于细胞增殖的调控:使用EdU荧光成像法分别检测各实验组细胞增殖能力,结果显示:与正常A549细胞组和对照组比较,mdig过表达A549细胞组的EdU阳性细胞百分比明显升高,而mdig沉默A549细胞组的EdU阳性细胞百分比却明显降低,实验同时使用了HUVEC细胞做了验证,并得到了相同的结果。Western blot方法分别检测PI3K/Akt和mTORC2/Akt信号通路主要生化指标和其下游调控细胞周期相关蛋白的蛋白修饰水平和表达量的变化,结果发现:mdig能够通过促进PDK1（Ser241）的磷酸化进而促进Akt（Thr308）的磷酸化,激活Akt蛋白进一步促进细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK2和CDK6的表达,抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂P18INK4C和P19INK4D的表达来促进细胞增殖。同时这部分实验结果还显示mdig能够促进Akt（Ser473）的磷酸化,其分子机制主要是通过促进mTORC2复合体的形成,mdig虽然不能够直接调控mTOR蛋白的表达量变化,但是mdig能够促进mTORC2复合体（mTOR+GβL+Rictor）中GβL和Rictor的表达来促进Akt（Ser473）的磷酸化,激活Akt蛋白,进而促进细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK2和CDK6的表达,抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂P18INK4C和P19INK4D的表达来促进细胞增殖。结论:1.Mdig通过抑制GSK-3β（Ser9）的磷酸化,进而促进β-catenin（P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin）的磷酸化,进一步抑制下游EMT发生的直接促进因子slug、snail、ZEB1表达,进而抑制A549细胞EMT的发生,从而抑制A549细胞的侵袭和转移。2.Mdig分别通过PDK1和mTORC2促进Akt（Thr308,Ser473）的磷酸激活,进一步促进细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK2和CDK6的表达,抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂P18INK4C和P19INK4D的表达来促进A549细胞的增殖。