目的本研究通过百草枯（PQ）腹腔注射小鼠构建PD样模型,首先观察PQ对小鼠神经行为学及DA能神经元的损伤作用。其次探讨α-Synuclein通过CD11b/PI3K通路调控NOX2在PQ诱导小胶质细胞异常激活中的作用机制。最后讨论牛磺酸（Tau）通过抑制小胶质细胞活化对PQ诱导的神经毒性的保护作用。为环境化学物PQ诱导的PD分子机制和治疗研究提供理论依据。方法1.PD样小鼠模型建立:选用48只SPF级雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组（n=12）和PQ染毒组（n=36）。染毒组小鼠每周腹腔注射15 mg/kg PQ两次,对照组注射同等容量0.9%Saline,连续注射8周。2.Tau保护模型建立:选用48只SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机分为4组:对照组（Con）:腹腔注射等容量0.9%Saline;Tau对照组（Tau）:腹腔注射150 mg/kg Tau;PQ染毒组（PQ）:腹腔注射15 mg/kg PQ;Tau干预组（Tau+PQ）:注射PQ前1 h腹腔注射150mg/kg Tau。每组12只小鼠,每周注射2次,连续注射8周。3.神经行为学观察:每周记录一次小鼠体重。观察各组小鼠的精神状态等一般行为变化。于末次给药后第二天取各组小鼠进行神经行为学测试。首先采用爬杆实验和步态测量实验检测各组小鼠的运动协调能力和步态改变,然后采用旷场实验和新物体识别实验测试各组小鼠的认知和学习记忆能力,最后采用悬尾实验和高架十字迷宫实验评价各组小鼠的抑郁和焦虑样行为。4.尼氏染色分析:制备中脑组织石蜡切片,检测黑质区神经元尼氏体数量及形态变化。5.免疫组织化学染色（IHC）分析:观察黑质区和纹状体区神经元核Neu N、DA能神经元TH的形态及数量变化;检测小胶质细胞Iba-1的活化水平和α-突触核蛋白（α-syn）的表达水平。6.免疫荧光双标染色（IF）分析:检测黑质区α-syn与TH的共表达情况以及黑质区Iba-1与TH的共表达情况。7.免疫印迹（Western blot）分析:测定中脑神经元核Neu N、DA能神经元TH、Iba-1、α-syn、纹状体区DA转运蛋白DAT、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1、i NOS）和信号通路关键蛋白CD11b、PI3K、PDK1、AKT、p-AKT以及细胞质和细胞膜中P47phox的蛋白表达变化。8.超氧化物阴离子荧光探针（DHE）分析:测定黑质区ROS的表达水平。结果（一）百草枯通过α-Synuclein介导CD11b/PI3K通路调控NOX2在神经炎症中的作用机制1.各组小鼠体重及一般行为变化:对照组小鼠在实验过程中一般情况良好。染毒组小鼠腹腔注射PQ后未立即出现明显行为学变化。但随着染毒时间的增加,出现毛发干燥杂乱、逃避反应慢。个别小鼠出现歪头、后背上弓、静止性震颤等症状。各组小鼠体重均呈稳步上升趋势,变化无明显差异。2.PQ对小鼠运动能力的影响:步态分析结果显示,PQ染毒组小鼠的步长较对照组无明显变化（P>0.05）,但步距逐渐减小,尤其染毒8周组变化最为明显（P<0.05）。爬杆实验结果显示,6周和8周染毒组小鼠的爬杆时间较对照组有增加趋势（P<0.05）。3.PQ对小鼠认知、记忆能力的影响:旷场实验结果显示,与对照组比较,PQ染毒组小鼠的移动距离减少,中央区域停留时间降低（P<0.05）。新物体识别实验中,随着染毒时间和剂量的增加,染毒组小鼠对新物体的触碰时间和次数均呈时间依赖性减少（P<0.05）。4.PQ对小鼠情绪的影响:悬尾实验结果显示,小鼠悬尾不动时间较对照组呈逐渐增加趋势（P<0.05）。高架十字迷宫实验中,PQ染毒组小鼠进入开放臂的时间和次数较对照组呈逐渐减少趋势（P<0.05）。5.PQ对小鼠黑质、纹状体DA能神经元的损伤效应:尼氏染色结果显示,PQ染毒组黑质区尼氏体数量较对照组明显减少（P<0.05）。IHC显示,PQ染毒组黑质区神经元胞体缩小、轴突纤维散乱、突起末端出现断裂,数量较对照组明显减少（P<0.05）。纹状体中DA神经元的轴突纤维阳性表达量也明显降低（P<0.05）。Western blot结果显示,与对照组比较,染毒组小鼠中脑神经元核Neu N、DA能神经元TH以及纹状体DA转运蛋白DAT的蛋白相对表达量均随PQ染毒时间的增加而降低（P<0.05）。6.PQ对α-synuclein表达水平的影响:IHC结果显示,PQ染毒组小鼠黑质区出现α-syn逐渐聚集增多,阳性染色呈棕黄色,表达水平较对照组呈增高趋势,尤其在染毒8周时最为明显。IF观察到PQ染组小鼠黑质区仅可见少量、稀疏的TH神经元（红色）,染色强度明显减弱并伴随α-syn沉积（绿色）,且α-syn荧光强度明显增强。Western blot结果显示,PQ染毒组小鼠中脑组织中二聚体和寡聚体形式的α-syn及S129-p-α-syn的蛋白相对表达量均呈时间依赖性升高（P<0.05）。7.PQ对小胶质细胞活化和M1极化的影响:IHC结果显示,与对照组比较,PQ染毒组小鼠黑质区和纹状体区小胶质细胞Iba-1随染毒时间增加呈胞体增大,突触变短、增粗,表达水平明显增高（P<0.05）。IF观察到,PQ染毒组小鼠神经元TH明显丢失（绿色）,分布稀疏散乱,荧光信号较对照组明显减弱。同时,小胶质细胞Iba-1的荧光信号逐渐增强（红色）。Western blot结果显示,PQ染毒组小胶质细胞Iba-1及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1、i NOS的蛋白相对表达量较对照组均明显升高（P<0.05）。8.PQ对CD11b/PI3K/NOX2通路的影响:Western blot结果显示,PQ染毒组信号通路中的膜识别受体CD11b以及信号传递的关键蛋白PI3K、PDK1、p-AKT的表达水平均明显升高,表现在PQ染毒8周组升高最为明显;而PQ染毒后,胞膜中的P47phox蛋白相对表达较对照组增高,而胞质中的蛋白表达降低（P<0.05）。DHE结果显示,PQ染毒组黑质区ROS表达水平明显升高,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。（二）牛磺酸通过抑制小胶质细胞活化在百草枯介导的神经炎症中的保护作用1.各组小鼠体重及一般行为变化:PQ染毒组小鼠毛发干燥杂乱、行动减少、对外界刺激不自主竖毛、逃避反应慢,个别小鼠出现歪头、竖尾等症状。对照组及Tau干预组小鼠未见明显行为变化。各组小鼠平均体重无明显差异（P>0.05）。2.Tau对PQ诱导的PD样小鼠运动功能的影响:步态分析结果显示,与对照组比较,PQ染毒组小鼠步距减少（P<0.05）;Tau干预组小鼠较PQ染毒组步距明显增加（P<0.05）。爬杆实验结果显示,PQ染毒组小鼠的爬杆时间较对照组增加（P<0.05）;Tau干预组小鼠爬杆时间较PQ染毒组减少（P<0.05）。3.Tau对PQ诱导的PD样小鼠认知功能的影响:旷场实验中,与对照组比较,PQ染毒组小鼠的移动距离降低,中央区域停留时间减少（P<0.05）;与PQ染毒组比较,Tau干预组小鼠移动距离和中央区域停留时间均明显增加（P<0.05）。新物体识别实验显示,与对照组比较,染毒组小鼠识别新物体时间出现减少的趋势（P<0.05）,而Tau干预组小鼠识别新物体的时间较染毒组明显增加（P<0.05）。4.Tau对PQ诱导的PD样小鼠情绪的影响:悬尾实验中,与对照组比较,PQ染毒组小鼠的悬尾不动时间增加,Tau干预组小鼠的悬尾不动时间较染毒组减少。高架十字迷宫实验中,PQ染毒组小鼠开放臂停留时间及次数较对照组均减少（P<0.05）。Tau干预组小鼠开放臂停留时间和次数较染毒组均增加（P<0.05）。5.Tau对PQ诱导的PD样小鼠黑质、纹状体神经元的影响:IHC结果显示,与对照组比较,PQ染毒组小鼠黑质区大部分神经元胞体轮廓不清晰、轴突消失,Neu N和TH阳性细胞数量及轴突纤维阳性表达量明显减少（P<0.05）;与PQ染毒组比较,Tau干预组小鼠黑质区神经元形态较为完整,呈椭圆或锥体型、胞质染色明显、胞体较大、突起明显、分布密集,Neu N和TH阳性细胞数目及轴突纤维阳性表达量明显增多（P<0.05）。Western blot结果显示,染毒组小鼠中脑TH、Neu N与纹状体DAT的蛋白相对表达量较对照组减少（P<0.05）;Tau干预组TH、Neu N和DAT的蛋白相对表达量较PQ染毒组明显增多（P<0.05）。6.Tau对PQ诱导的PD样小鼠中脑α-synuclein影响:IHC结果显示,PQ染毒组小鼠黑质区出现大量α-syn,阳性染色呈棕黄色,表达水平明显升高（P<0.05）;与PQ染毒组比较,Tau干预组小鼠黑质区α-syn阳性染色明显减弱。Western blot结果显示,PQ染毒组二聚体、寡聚体和S129-p-α-syn的蛋白相对表达量较对照组明显升高（P<0.05）。Tau干预组二聚体、寡聚体和S129-p-α-syn的蛋白相对表达量较PQ染毒组明显降低（P<0.05）。7.Tau对PQ诱导的PD样小鼠小胶质细胞的影响:IHC结果显示,与对照组比较,PQ染毒组Iba-1阳性染色的小胶质细胞胞体增大、突触增粗,数量增多。而Tau干预组Iba-1阳性染色细胞胞体较小、分布稀疏,阳性细胞数较少（P<0.05）。IF结果与IHC一致,表现为PQ染毒组黑质区神经元核Neu N阳性数量减少、荧光信号降低（绿色）,同时,Iba-1荧光信号明显增强（红色）。而Tau干预组Neu N荧光信号较PQ染毒组增强,Iba-1的荧光信号减弱。Western blot结果进一步显示,与对照组比较,染毒组小鼠中脑Iba-1蛋白相对表达量增高,而Tau干预组Iba-1的表达较PQ染毒组明显降低（P<0.05）。8.Tau对PQ诱导的PD样小鼠中脑炎症因子的影响:Western blot结果显示,PQ染毒组炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、HMGB1和i NOS的蛋白相对表达量较对照组均升高（P<0.05）。而Tau干预组IL-6、IL-1β、TNF-α、HMGB1和i NOS的蛋白相对表达量较PQ染毒组均明显降低（P<0.05）。9.Tau对PQ诱导的CD11b/PI3K/NOX2通路激活的影响:Western blot结果显示,PQ染毒组CD11b、PI3K、PDK1、p-AKT的蛋白相对表达量均明显增高。细胞质中的P47phox表达量降低,细胞膜中的蛋白表达升高（P<0.05）。而Tau干预组中CD11b、PI3K、PDK-1、p-AKT蛋白相对表达水平较PQ染毒组均明显降低,同时胞质中的P47phox表达量升高,胞膜中的蛋白表达降低（P<0.05）。DHE显示,PQ染毒组ROS表达水平较对照组呈增高趋势,而Tau干预组ROS表达较PQ染毒组呈降低趋势（P<0.05）。结论1.PQ通过诱导病理性α-synuclein聚集激活CD11b/PI3K/NOX2通路,介导小胶质细胞异常活化,引发活性氧和炎性因子释放失控,损伤DA能神经元,诱导小鼠出现抑郁、焦虑、认知功能和运动功能障碍。2.Tau通过抑制CD11b/PI3K/NOX2通路的激活,下调小胶质细胞M1型标志蛋白,有效减少PQ诱导的DA能神经元损伤和α-syn聚集,改善了PD样小鼠的情绪、运动及认知功能。