研究背景及目的 椎间盘突出发病的高峰期是40～50岁。有4％～6％的椎间盘突出可出现症状，其中男性的发病率是女性的3倍。 介入放射学治疗腰椎间盘突出症包括了许多经皮微创技术，如：化学溶核术、经皮自动椎间盘切除术、激光椎间盘切除术、电极管纤维环修补术。这些操作可以获得约70％～75％的优良率[1][2]，但是均存在一些副作用或者并发症。用木瓜酶作化学溶核术，除发生横断性脊髓炎外，瘫痪的发生率为0.3～0.5％，数周乃至数月剧烈的背部疼痛或强直发生率为20～40％，1％会出现过敏反应[3]。因为其潜在的并发症会产生很多危害，故木瓜酶化学溶核术在美国并没有得到推广。 胶原酶是由梭状芽孢杆菌分泌的酶，胶原酶对胶原有高度特异性，但对普通蛋白如：纤维蛋白、血红蛋白、角蛋白和弹性蛋白没有溶解作用。选择胶原酶运用于化学溶核术的原因是：除胶原酶以外，其他酶对这种天然、未变性的胶原没有溶解作用。 注射胶原酶的治疗机理是：胶原酶在胶原纤维的不同位点水解胶原[4]，使椎间盘内压力降低，突出部分减少，缓解对神经根的压迫。 在中国，胶原酶化学溶核术是一种较普遍应用于治疗腰椎间盘突出症的微创治疗方法。一般盘内注射胶原酶的剂量为600u，盘外注射1200u。虽然以往的动物实验[5]及临床研究[6]证明使用治疗剂量范围内的胶原酶是安全的，但是我们的经验和文献报道都有以下并发症：终板的破坏及椎间盘炎；术后短期内出现的腰痛加剧初步分析和胶原酶的用量有关，术后椎间隙狭窄，脊椎小关节过度重叠，椎间孔变小，会导致神经通道变窄，压迫神经根，从而影响远期疗效；术后MRI检查发现治疗后的椎间盘周围存在慢性炎性反应。为达到充分溶解胶原又尽可能减少上述并发症的目的，必须个体化使用胶原酶剂量。 不同的髓核退变程度，胶原含量是不相同的，而胶原酶的溶解效应是剂量依赖性，为达到个体化使用胶原酶剂量的目的，必须解决2个问题：1.使用无创的检查方法评价退变髓核中胶原蛋白的含量；2.了解胶原酶化学溶解术中酶促反应的影响因素，特别是酶效价(即单位胶原酶能够溶解的胶原蛋白量)。中山一院余文昌[7]等已经建立胶原含量与MRI信号强度指标之间的线性回归方程，提供了通过测量MRI信号强度来计算髓核内胶原含量的途径。本课题是其研究结果的深入和延续。 本课题拟在临床研究的基础上，结合生物化学、免疫组化等技术，探讨胶原酶在化学溶核术中对细胞外基质的影响规律。第1部分：胶原酶化学溶核术后，通过临床及MRI随访，探讨化学溶核术的疗效及并发症，分析并发症产生的原因；第2部分：研究胶原酶化学溶核术中酶促反应的影响因素，探索胶原酶剂量与胶原蛋白含量间的关系，即酶效价方程，提供根据胶原蛋白含量推算胶原酶剂量的方法；第3部分，研究胶原酶化学溶核术对蛋白多糖含量的影响，分析胶原酶化学溶核术后椎间盘退变速度加快的原因；第4部分；通过研究金属基质蛋白酶-3(MMP-3)在退变椎间盘髓核组织中的表达及胶原酶化学溶核术对其表达的影响，从分子医学的角度阐述胶原酶影响蛋白多糖含量的机理。本课题从临床和基础研究的角度初步提出胶原酶剂量个体化使用的理论基础及临床应用价值。 第一部分：突出组织直接注射胶原酶治疗脱出型腰椎间盘突出症的临床研究方法：本组共76例患者，其中男性52例，女性24例。年龄为24～65岁，平均年龄45.2岁。临床症状结合影像学资料确诊为脱出型腰椎间盘突出症。病变区域L4～5和/或L5～S1椎间盘75例，L3～4椎间盘1例。采用经棘突间入路直接穿刺椎间盘脱出组织并注射600u的胶原酶。随访时间为半年～3年，分析随访的MRI和临床资料。 结果：76例患者治愈59例，治愈率为77.6％(59/76)，有效9例，总有效率为89.5％(68/76)。其中32例进行了MRI随访(术前、术后7天、1个月、3～24个月)，3例(3/32)MRI复查发现椎间盘变窄。17例(17/76)出现一过性下腰部疼痛，无严重并发症发生。 第二部分：胶原酶化学溶核术中酶促反应影响因素的研究方法：1.10例退变的髓核组织分别匀浆后加入相同剂量的胶原酶，根据胶原酶的作用时间每例均分为12组，即：0h、0.25h、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h，测定各组A550吸光值，研究胶原酶作用的时间规律；2.8例退变的髓核组织分别匀浆后加入相同剂量的胶原酶，根据加入试管中的匀浆量，每例均分为0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、1.0ml组，测定各组A550吸光值，研究底物剂量对酶促反应的影响；总量组底物剂量为1.0ml，直接测量A550吸光值作为对照。 3.8例退变的髓核组织分别匀浆后加入胶原酶，根据加入的胶原酶剂量，每例均分为0u、3u、6u、9u、12u、15u、18u、21u、24u、27u、30u、33u组，测定A550吸光值并分析酶的效价。 结果： 1.时间对胶原酶酶促反应的影响：0～12h各组，组间差异存在统计学意义(P＜0.05)，12h～48h各组间差异无统计学意义(F=0.25，P=0.899)。12h～48h各组的吸光度高于0～6h各组(P＜0.05)。 2.底物剂量对胶原酶酶促反应的影响：0～0.6ml组间差异有统计学意义(P＜0.05)，0.7～1.0ml组间差异没有统计学意义(P＞0.05)，0.7～1.0ml各组的吸光度高于0～0.6ml组(P＜0.05)；0～1.0ml组与总量组的A550吸光值差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.胶原酶剂量对酶促反应的影响：0～18u各组组间差异有统计学意义(P＜0.05)；21～33u组分布于同一组，组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。胶原酶剂量(x)与A550吸光值(Y)间的回归方程Y=0.042+0.032X。 第三部分：胶原酶对退变椎间盘髓核组织中蛋白多糖影响的实验研究方法：10例退变的椎间盘髓核匀浆组织在加入胶原酶以后，根据加入的胶原酶剂量的不同分为0u、3u、6u、9u、12u、15u、18u、21u、24u、27u、30u组，分别测量糖胺多糖的水解量，另取总量组不加酶，直接测量糖胺多糖总量作对照。 结果：在0～6u组间，糖胺多糖水解量的差异有统计学意义(P＜0.05)；在9～30u组间，差异没有显著性(P＞0.05)。与总量组比较，最大水解程度为57.14％～64.76％。 第四部分：基质金属蛋白-3在退变椎间盘髓核组织中的表达及胶原酶对其表达的影响方法： 1.对30例退变椎间盘髓核，按年龄分为3组：1组(50～65岁)、2组(35～50岁)、3组(20～35岁)，检测MMP-3的表达； 2.对5例退变髓核，检测在胶原酶作用的不同时间点，MMP-3的表达。 结果： 1.各组间MMP-3的表达差异显著(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，1组最高，3组最低； 2.胶原酶作用以后，MMP-3表达增高，并随时间而变化，3h为最大值，随后降低，12h仍高于0h点(P＜0.05)。 全文结论： 1.经棘突间入路直接穿刺脱出的椎间盘组织行胶原酶髓核溶解术治疗脱出型腰椎间盘突出症是一种有效的治疗方法，术后椎间盘退变速度加快、腰背部疼痛等并发症与胶原酶过量有关。 2.时间因素、底物剂量和酶剂量因素是胶原酶化学溶核术中酶促反应的主要影响因素。通过酶效价方程，可以使用胶原蛋白含量推算相对应的胶原酶剂量。 3.胶原酶在化学溶核术中可以部分水解蛋白多糖。 4.在退变的髓核组织中，MMP-3的表达量随年龄的增加而增加；胶原酶作用以后，MMP-3的表达量增加，在胶原酶作用时间内呈规律性变化。