细菌性阴道病(bacterialvaginosis, BV)是育龄期妇女的常见病、多发病,是由于阴道内微生态平衡失调,非正常阴道菌生长过盛所致对阴道有保护作用的乳酸杆菌减少,厌氧类细菌大量繁殖导致的一类多微生物病。BV是妊娠妇女最主要的并发疾病,与胎儿低体重、早产、新生儿死亡及产妇继发感染等不良妊娠结局有关。临床用甲硝唑和克林霉素按标准方法治疗BV,3月内复发率高达30%,其中最主要原因是对BV的病因,特别是病原学缺乏深入了解,很多细菌不易培养,导致阴道分泌物的病原菌组成和分类研究进展缓慢,因而缺乏有效的预防和治疗措施。近年来,不依靠细菌培养测定细菌种属的分子生物学方法得到应用推广,使研究者可以探索微生物群落内部的种群结构和变迁。本项目在前期研究的基础上,以BV阳性和阴性妇女为研究对象,采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和DNA测序技术分析细菌16S rDNA的特征序列信息,将16S rDNA与数据库进行比对,从“属”、“种”水平对阴道分泌物中的细菌类群进行鉴定。应用凝胶图像分析系统计算细菌种属的相对含量。采用对应分析法证明BV相关细菌,采用logistic回归分析不同菌群组成以及其他相关因素与BV的关联,为进一步防治研究提供依据。研究目的探讨与BV相关的细菌种属；研究正常阴道细菌和BV相关菌的相对含量与BV的相关性；探讨人口学特征以及卫生习惯等宏观因素与BV的关联性,为BV的病因研究提供线索,为BV的防治研究提供依据。研究内容和方法一、阴道微生物群落的检测方法采用革兰氏染色Nugent评分法结合商业试剂盒对BV作出临床诊断。以目前常用的DGGE方法为基础,重新设计了DGGE实验装置的关键部件制胶板组件,扩展了DGGE方法的条带分辨率范围和装置使用的灵活性,并采用切胶重新PCR扩增并测序的手段获得细菌的16S rDNA遗传信息,并与数据库进行比对,以序列相似程度≥97.5%作为序列同源性标准。利用DGGE凝胶图像分析系统计算每个细菌标本中各细菌种属的相对含量,实现了对阴道微环境细菌群落的定性和定量分析的有机结合。二、阴道菌群构成及其他相关因素与BV的相关性(BV的危险因素研究)用自行设计的调查问卷调查196名育龄期妇女,问卷内容包括一般人口学特征、卫生习惯、婚育史以及主要妇科诊断等。采用对应分析法确定BV相关细菌,采取卡方检验分析不同细菌种属在BV阳性组和BV阴性组的检出率差异,采用t检验分析不同菌属的相对含量在2组间的差异,logistic回归分析不同菌群组成以及其他相关因素与BV的关联强度。研究结果第一部分阴道微生物群落检测方法的研究1.全部196名妇女共检出细菌种属59种,正常组检出14种,BV组检出55种。2.68名BV阴性妇女中,每名妇女可检出1-5个不同菌属,平均检测到2.59种；128名BV阳性妇女中,每名妇女可检测到1-9个不同菌属,平均检测到4.05种,二者比较有显著统计学差异(P＜0.001)。3.正常组检出率在前5位的细菌分别为惰性乳酸杆菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸杆菌(Lactobacillus ultunensis)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、阴道加特纳菌(Gardnerella vaginalis)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve);BV组检出率在前5位的细菌分别为惰性乳酸杆菌(Lactobacillus iners)、阴道加特纳菌(Gardnerella vaginalis)、ultunensis乳酸杆菌(Lactobacillus ultunensis)、阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和fungorum伯克霍尔德氏菌(Burkholderia fungorum)。4.细菌进化关系分析显示59中检出细菌分为2个大类,分别定义为阴道正常菌群,和BV相关菌群。其中阴道正常菌群包括双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、massiliae消化链球菌(Peptostreptococcus massiliae)、Amnionii纤毛菌属(Leptotrichia amnionii)、惰性乳酸杆菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸杆菌(Lactobacillus ultunensis)、和约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)共6种。5.研究发现有2个检出的细菌种属16S rDNA特征DNA序列与数据库序列的同源性<97.5%(96.835% vs Lactobacillus ultunensis;86.184% vs Mycoplasma muris),可能为细菌新变种。第二部分细菌性阴道病的危险因素研究在第一部分的研究基础上,本部分研究阴道菌群的构成和其他因素与BV发生的相关性,主要研究结果如下：1.与正常组和BV组相关联的阴道菌群发现与正常组相关联的细菌为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳杆菌9Lactobacillus ultunensis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis);与BV组相关联的细菌为Algoriphagus aquatilis、阴道阿托波氏菌(阴道奇异菌)(Atopobium vaginae)、fungorum伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia fungorum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。2.正常组和BV阳性组阴道微生态构成特点：(1)乳酸杆菌在2个组中均为检出的优势菌,总乳酸杆菌Lactobacillus在病例组和正常组中的检出率分别为92.97%和95.59%,检出率的差异无统计学意义(Fisher’s exact P=0.548),但其在正常组中的含量显著高于BV阳性组(72.84% vs 51.27%,t=4.440,P＜0.001)。(2)阴道加特纳菌(Gardnerella vaginalis)作为细菌性阴道病的标志性细菌,在BV组中的检出率和相对含量均高于正常组,但正常组也有比较高的检出率,所以不能单纯以阴道加特纳菌阳性与否作为诊断BV的依据。(3)发现其他BV相关菌包括阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和普雷沃菌(Prevotella timonensis),与文献报道一致。(4)研究发现伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia fungorum)、micronuciformis巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、Algoriphagus aquatilis与BV相关,文献报道较少,其与BV的真实联系尚需进一步研究确证。(5)BV阳性组的细菌载量显著高于正常组。3.多因素统计分析发现BV的危险因素初婚年龄较小、阴道pH值偏高、阴道乳酸杆菌含量低是发生BV的危险因素；妊娠的妇女患BV的危险性是已生育妇女的36倍(P=0.0002),未孕育的妇女患BV的危险性是已生育妇女的4.08倍,但关联没有统计学意义(P=0.3150)；经常阴道冲洗(用水洗或用消毒液洗)的妇女与偶尔阴道冲洗的妇女相比有更高的患BV危险性；具有高中及以上学历者患BV的危险是初中及以下学历者的4.98倍。结论1.除阴道加特纳菌Gardnerella vaginalis、阴道阿托波氏菌(阴道奇异菌)(Atopobium vaginae)作为细菌性阴道病的标志性细菌外,本研究发现其他BV相关菌包括(Algoriphagus aquatilis)、fungorum伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia fungorum)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。2.BV阳性阴道微环境细菌种类和细菌总量显著高于正常对照,而正常对照的乳酸杆菌含量显著高于BV阳性组。BV阳性和正常对照阴道细菌种群之间具有较大的遗传距离。3.除阴道pH值偏高、阴道乳酸杆菌含量低、经常阴道冲洗外,本研究首次发现初婚年龄较小、妊娠、和高学历是BV的危险因素。