研究背景及目的失血性休克（hemorrhagic shock,HS）指机体因创伤或失血性疾病导致短时间内大量丢失血液,进而引起严重多器官损伤最终导致死亡的病理状态。及时、快速控制出血及早期正确有效的复苏是失血性休克救治的关键环节。针对创伤失血性休克,目前国内外指南一致推荐“损伤控制性复苏策略”,其核心内容之一即“允许性低血压”的实施,也就是在出血尚未控制的阶段,采用“限制性液体复苏”和“止血性复苏”的方案保障重要器官的有效灌注,防止“创伤性凝血病”和机体过度的氧化应激损伤。但是,战场复杂条件及院前急救等野外环境下,常常面临血源缺乏、后送困难、监护治疗设备欠缺等不利因素,低血压复苏意味着机体长时间处于低灌注状态,时间越久细胞缺氧越严重,心、肾、肺、肝、肠等器官损伤程度更广泛,后期死亡率更高。因此,在此条件下如何维持创伤失血性休克伤员的血流动力学稳定、增强器官的缺血耐受能力成为严峻挑战。随着“冬眠”现象及机制研究的不断深入,科学家们发现冬眠过程存在觉醒-冬眠周期,而每一个周期即类似缺血再灌注过程,伴随神经内分泌、血压心率节律、温度、代谢等生理变化。虽然目前为止,冬眠的调控机制仍不明了,但冬眠的器官保护效应却得到充分验证。能够模拟冬眠效应的许多药物如脑啡肽（D-Ala2-Leu5-enkephalin,DADLE）、褪黑素（Melatonin）、H2S气体、ALM溶液（腺苷、利多卡因、镁溶液）等等,均显示可减轻缺氧引起的器官损伤、炎症反应,增加机体对缺氧、缺血、再灌注的抵抗能力。大量动物实验已经证实,DADLE、褪黑素在缺血、缺氧等条件下对脏器的保护作用,能够减少液体复苏量、减轻炎症反应、延长生存时间、提高生存率,增强心、肝、肺、脑等对缺氧、缺血、再灌注损伤的耐受能力。课题组前期研究同样证实了DADLE、褪黑素的器官保护作用。虽然在心肌细胞中DADLE可通过激活促生存激酶、调节自噬、关闭线粒体通透性转换孔（m PTP）等通路发挥保护作用;在血管内皮细胞中褪黑素可阻止钙超载,保护其免受氧化应激损伤,但对DADLE和褪黑素的器官保护作用仍缺乏足够了解。近年研究表明内质网-线粒体微区与心肌损伤密切相关,缺血/再灌注损伤首先通过Ripk3导致微区内IP3R表达上调,进而引起线粒体钙超载,随后通过Ca MKII–m PTP或XO–ROS–m PTP途径激活再灌注心肌中的坏死性信号传导,DADLE和褪黑素的器官保护机制是否与该通路有关尚未研究。为进一步探讨DADLE及褪黑素在缺血、缺氧条件下稳定血流动力学的效应及器官保护的作用,本研究利用大鼠失血性休克模型在早期复苏中联合应用DADLE和褪黑素（即将二者联合配置为DM复苏液）,以血压控制为复苏目标,通过观察复苏液体总量、器官损伤生物标记物水平变化、重要脏器病理变化,明确联合用药处理的器官保护效应。同时,分子生物学方法和免疫组织化学测量心肌细胞凋亡通路关键分子细胞色素c、Caspase-3及内质网-线粒体微区Ripk3、IP3R/VDAC及ROS相关蛋白表达水平,深入分析DADLE和褪黑素在失血性休克时器官保护作用的分子机制。方法随机将30只雄性SD大鼠分为5组,每组6只,分别为:Shock组、Na CL组、Melatonin组、DADLE组、DM组。从右侧股动脉插管处放血,在10分钟内将平均动脉压降至35-40 mm Hg并维持此状态1小时,分组给药并使用生理盐水进行液体复苏,复苏目标MAP=55-60mm Hg,在复苏1h、2h、3h时间段于股静脉采集静脉血0.5ml,离心取血清,复苏维持3h,最后处死大鼠。实验期间持续监测平均动脉压、心率并记录补液总量。ELISA法检测血清中下列器官损伤标志物:谷丙转氨酶（ALT）、肌钙蛋白I（c Tn I）、肌酐（Cr）;处死大鼠后取肝、肺、肾组织HE染色观察病理变化。Western Blot检测大鼠心肌组织下列蛋白表达水平:Cyt-c、Caspase-3、Ripk3及XO;免疫组化观察心肌IP3R、VDAC表达水平;免疫荧光观察ROS表达水平。结果1.Melatonin组、DADLE组和DM组在3h内液体复苏总量分别是:19.17±3.95ml、12.75±2.42ml、13.5±3.81ml,明显少于Na CL组34.56±9.06ml（P＜0.05）。DM组与Melatonin组、DADLE组相比复苏所用生理盐水无显著性差异（P＞0.05）。2.在复苏2h、3h时间段,DM组cTnI水平（159.63±7.08ng/L、185.25±5.80 ng/L）与Shock组（218.14±8.70 ng/L、248.94±9.38 ng/L）、Na CL组（215.88±2.36ng/L、240.07±7.53 ng/L）、DADLE组（200.95±6.87 ng/L、216.10±8.70 ng/L）、Melatonin组（196.45±5.29 ng/L、221.41±3.92 ng/L）相比,显著降低（P＜0.05）。在复苏1h、2h、3h时间段Cr水平,DM组（41.33±9.06μg/ml、57.00±4.06μg/ml、64.59±43.03μg/ml）与Shock组（94.36±4.41μg/ml、122.34±7.49μg/ml、150.39±3.37μg/ml）、Na CL组（88.11±5.53μg/ml、117.26±2.40μg/ml、134.82±6.11μg/ml）、DADLE组（91.44±7.26μg/ml、97.92±1.69μg/ml、119.18±7.07μg/ml）、Melatonin组（87.14±4.89μg/ml、114.27±6.57μg/ml、127.33±8.16μg/ml）相比明显降低（P＜0.05）。3.DADLE组、DM组与Shock组、Na CL组、Melatonin组相比,肺组织评分显著降低,肺间质炎症反应较轻,少量炎细胞浸润,肺泡出血较轻（P＜0.05）。DM组与Shock组、Na CL组、DADLE组、Melatonin组相比肝细胞损伤较小且结构稳定、肾小管管腔无明显扩张,坏死碎片较少,肝肾评分显著降低（P＜0.05）。4.早期复苏中联合应用DADLE、Melatonin与单独使用DADLE、褪黑素相比较,可显著降低心肌细胞中Cyt-c、Caspase-3表达水平。5.Melatonin组、DADLE组、DM组与单独使用生理盐水复苏的NaCL组相比较IP3R、VDAC表达水平显著降低（P＜0.05）。联合应用的DM组与单独用药的Melatonin组、DADLE组相比,Ripk3、IP3R、VDAC、ROS表达水平无统计学意义（P＞0.05）。结论失血性休克复苏早期应用DADLE、褪黑素均可显著减少复苏液体总量,明显降低心肌细胞中细胞色素c及Caspase-3表达水平,降低AST、c Tn I、Cr等器官损伤标志物水平,同时显著下调心肌细胞中Ripk3、XO表达、降低IP3R/VDAC表达水平,减少ROS生成,而联合应用DADLE、褪黑素虽未能进一步减少液体复苏总量,但器官损伤程度进一步降低,尤其是肾保护功能增强,组织细胞凋亡程度进一步减轻。总之,联合应用DADLE和褪黑素可增强失血性休克复苏期器官保护效应,其作用机制可能涉及多种细胞信号途径,需进一步深入研究。