目的:　　本课题主要在实验室前期研究的基础上，进一步深入探讨CGA抑制APAP肝毒性的分子机制，同时观察CGA是否可以抑制MCT诱导的HSOS及其机制，从而为临床上药物性肝损伤，尤其是APAP和PAs肝毒性的解毒提供一定的实验依据，也为阐明CGA的保肝活性提供一定的科学依据。　　方法:　　1.在人正常肝L-02和肝癌HepG2细胞上，采用MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide)实验检测CGA对APAP及其毒性代谢产物N-acetyl-p-benzoquinonimine(NAPQI)诱导肝细胞毒性的抑制;在L-02细胞上采用活性氧(reactive oxygen species，ROS)实验检测CGA对APAP诱导肝细胞氧应激损伤的抑制。　　2.采用MTT法、双荧光素酶报告基因法、Western-blot、Real-time PCR等实验，结合运用抑制剂和siRNA，揭示CGA通过调控细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated protein kinase1/2，ERK1/2)介导的核因子E2相关因子-2(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)信号通路抑制APAP诱导肝氧应激损伤的机制。　　3.采用分子对接实验揭示CGA对Nrf2与其抑制蛋白Kelch状ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)相互作用的影响。　　4.CGA预防给药抑制APAP肝毒性的动物实验:ICR小鼠连续给药CGA(10，20，40 mg/kg)6天，末次给药后lh再给药APAP(300 mg/kg)，APAP给药后4h取血、取肝组织。检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)/谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)酶活力、肝组织还原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)含量以及Nrf2的核转位，在体内动物水平证实Nrt2参与调控了CGA抑制APAP的肝毒性。进一步利用Nrf24基因敲除小鼠，通过检测动物血清ALT/AST酶活力和肝组织病理切片观察，最终确证Nrf2在CGA抑制APAP肝毒性中的重要作用。　　5.CGA治疗给药抑制APAP肝毒性的动物实验:ICR小鼠先给药APAP(400mg/kg)，给药后1h再给药CGA(10，20，40 mg/kg)，APAP给药后4h取血、取肝组织。检测血清ALT/AST酶活力，进行肝组织病理切片观察，采用Western-blot，Real-time PCR，ELISA等实验结合髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性检测，揭示CGA通过抑制Toll样受体3/4(Toll-like receptors3/4，TLR3/4)和核因子κB(nuclear factorκB，NFκB)信号通路缓解APAP诱导炎性肝损伤的机制。　　6.CGA治疗给药抑制MCT诱导HSOS的动物实验:SD大鼠先给药MCT(90mg/kg)，分别在给药6h和30h后再给药CGA(20 mg/kg)，MCT给药后48 h取血、取肝组织。检测血清各项生化指标，进行肝组织病理观察和肝组织电镜分析，采用Western-blot，Real-time PCR等实验，揭示CGA通过调控TLRs/NFκB，Nrf2等信号通路抑制MCT诱导HSOS的机制。　　结果:　　1.MTT实验结果显示，CGA显著逆转了L-02和HepG2细胞上APAP和NAPQI降低的细胞存活率;CGA还显著减少了L-02细胞上APAP诱导的ROS产生。　　2.双荧光素酶报告基因和Western-blot实验结果显示，CGA与细胞孵育18h能显著增加Nrf2的转录激活和核转位。进一步运用了Nrf2 siRNA结合MTT实验发现，CGA对APAP肝细胞毒性的保护作用明显被抑制。Western-blot，Real-timePCR实验的结果显示，CGA可以提高Nrf2调控的下游分子血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和醌氧化还原酶(NAD(P)H dehydrogenase(quinone1)，NQO1)的基因和蛋白表达。运用抑制剂结合MTT实验发现，HO-1和NQO1的抑制剂可以减弱CGA对APAP肝细胞毒性的保护。CGA可以诱导ERK1/2的持续磷酸化，ERK1/2抑制剂可以减弱CGA对APAP肝细胞毒性的保护。CGA可以诱导Nrf2的磷酸化，而ERK1/2抑制剂可以抑制CGA诱导增加的Nrf2磷酸化及其随后的核转位，双荧光素酶报告基因实验发现运用ERK2siRNA后可以降低CGA增加的Nrf2转录激活。CGA可以降低蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)2A-A和PP5的表达。　　3.分子对接实验结果提示CGA可以与Keap1上的Nrf2结合位点相互作用，从而阻止了Nrf2与Keap1的结合，释放Nrf2，诱导Nrf2的转录激活。　　4.CGA预防给药抑制APAP肝毒性的动物实验:CGA给药可以降低APAP升高的血清中ALT/AST酶活力，逆转APAP降低的肝GSH含量，并增加肝组织中Nrf2的核转位。Nrf2-/-基因敲除小鼠实验的结果发现:野生型小鼠给药APAP和CGA后，CGA可以降低APAP升高的血清ALT/AST酶活力，病理切片观察也证实了CGA对APAP诱导肝毒性的抑制;而在Nrf2-/-小鼠上，CGA对APAP肝毒性的抑制作用则完全消失。　　5.CGA治疗给药抑制APAP肝毒性的动物实验:CGA给药可以降低APAP升高的血清中ALT/AST酶活力、肝组织中MPO活性。肝组织病理观察进一步证实了CGA治疗给药对APAP肝毒性的抑制作用。Western-blot，Real-time PCR以及ELISA的实验结果显示，治疗给药CGA可以降低肝组织中TLR3，TLR4，髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88，Myd88)的蛋白表达，抑制了NFκB信号通路的激活，继而降低下游炎性因子，如肿瘤坏死因子(tumornecrosis factorα，TNFα)，白介素(interleukin，IL)-1β，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1，IL-6和角质细胞趋化因子(keratinocyte chemoattractant, KC)的基因和蛋白表达，从而缓解了APAP诱导的肝炎性损伤。　　6.CGA治疗给药抑制MCT诱导HSOS的动物实验:大鼠血清生化指标检测、肝组织病理切片观察、肝组织电镜分析和肝组织中基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotein9，MMP9)蛋白表达的实验结果显示，CGA可以有效的改善MCT诱导的HSOS。Western-blot，Real-time PCR结果显示，CGA可以通过抑制TLRs/NFκB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3 kinase，PI3K)信号通路抑制MCT诱导的HSOS，CGA还能通过激活Nrf2来抵御MCT诱导的HSOS。　　结论:　　1.在体外细胞水平发现CGA可以抑制APAP及其毒性产物NAPQI诱导的肝细胞毒性。体内动物实验还发现CGA预防给药和治疗给药都可以抑制APAP诱导的肝毒性。CGA治疗给药还可以抑制MCT诱导的HSOS。　　2.深入机制研究发现:CGA可以诱导重要的抗氧化转录因子Nrf2的激活，随后增加其下游抗氧化酶HO-1和NQO1的表达，从而在CGA预防给药抑制APAP肝毒性中发挥了重要的调控作用。CGA诱导Nrf2激活的机制为:CGA一方面可以通过降低蛋白磷酸酶PP2A-A，PP5的表达，减少了ERK1/2的脱磷酸化，促使ERK1/2长时间的磷酸化，进而诱导Nrf2磷酸化，导致了Nrf2的转录激活;另一方面CGA通过与Keap1上Nrf2结合位点的相互作用，阻止了Nrf2与Keap1的结合，释放Nrf2导致其转录激活。　　3.CGA治疗给药抑制APAP肝毒性的机制研究发现:CGA通过抑制TLR3/TLR4-NFκB信号通路，减少下游炎性因子TNFα、IL-1β、MCP-1、IL-6和KC的表达，从而缓解了APAP诱导的肝炎性损伤。　　4.CGA治疗给药抑制MCT诱导HSOS的机制研究发现:CGA可以抑制TLRs/NFκB信号通路，增加Nrf2信号通路的激活，发挥了抑制MCT诱导HSOS的作用，其中MAPKs和PI3K信号通路也有一定的参与。