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自噬是一种发生在所有真核细胞中的蛋白质降解途径,通过该途径它可以降解细胞质成分以产生大分子物质进行能量代谢以适应不断变化的营养条件。细胞自噬还可以清除多余和受损的细胞器从而维持细胞内稳态,在细胞生长和死亡过程中具有双重调节作用。另外,自噬还被认为是细胞迁移的调节因子,可促进细胞运动。细胞自噬蛋白ATG1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它与ATG13组成的激酶复合物在细胞自噬的启动阶段发挥重要作用。ATG1可以和一些执行细胞自噬的蛋白相互作用,而且有很多调控细胞自噬的信号传导通路汇集在ATG1。因此ATG1可能是一个调控细胞自噬途径的一个关键调节点。诸多研究表明,细胞自噬基因Atg1在动物中枢神经（CNS）细胞的发育和形成中发挥重要的调控作用,但具体的分子机制有待继续深入研究。涡虫以再生能力强而闻名,其头部切除后1周就可以再生出一个新的头部。因此,涡虫是研究CNS再生的绝佳动物模型。CNS再生涉及细胞的增殖、分化和迁移等细胞生物学过程,细胞自噬可能在其中发挥重要作用,但有关细胞自噬在涡虫CNS再生中的研究还未见报道。本文通过RNAi干扰、原位杂交、免疫荧光、q PCR等实验技术深入探究了Atg1在涡虫脑神经再生中的作用,以及RNAi-Atg1对涡虫干细胞相关基因表达的影响。研究的结果如下:（1）日本三角涡虫Atg1（DjAtg1）基因的鉴定和同源性分析在日本三角涡虫转录组数据库中进行筛选,得到的DjAtg1 c DNA序列全长2625 bp,开放阅读框（ORF）为2445 bp,编码814个氨基酸的多肽。DjATG1与其它物种的丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白的氨基酸序列的多序列比对结果显示,DjATG1具有丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族的功能结构域S-TKc,属于丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白,且与线虫、小鼠、斑马鱼、黑腹果蝇和人属的比对相似度达46.15%,具有高度保守性。（2）DjAtg1基因的时空表达模式分析原位杂交结果显示,在整体涡虫中,DjAtg1主要在头神经节处表达,在肠道组织中有弱表达。涡虫再生过程中,DjAtg1的杂交信号主要集中在涡虫躯干前端新生的芽基或头部的神经节位置,呈倒“U”型,且在再生第5天时,DjAtg1的杂交信号明显更强。q PCR结果显示切割后的涡虫在再生过程中,DjAtg1的表达量显著升高,并在再生第5天达到最大值。DjAtg1基因的时空表达模式表明DjAtg1可能是涡虫再生所必需的。（3）RNAi-DjAtg1对涡虫神经相关基因表达的影响通过对神经抗体anti-SYNORF1和anti-Ptyr,及一系列的与神经相关的标志基因,包括pc2、Chat、Th、Gad、Otx、Netrin1、Net R、Coe和Sox P2基因进行免疫荧光和原位杂交实验。结果显示DjAtg1基因干扰后,涡虫新再生的脑神经节模式异常,与对照组相比,两个头神经节明显小且短,且它们的连接处明显增厚,头神经节向外侧投射的神经轴突短。另外,与对照组相比,干扰组涡虫再生的神经元明显异常,神经元相关标志基因的阳性细胞数显著减少,且神经转录因子的杂交信号明显弱于对照组,甚至几乎无信号。基于上述结果,我们推测DjAtg1基因可能是涡虫神经再生的关键因子,可能通过影响神经轴突的伸长和运输功能影响神经的再生和发育。（4）RNAi-DjAtg1对涡虫干细胞相关基因表达的影响免疫荧光结果显示,DjAtg1干扰后,整体涡虫和再生涡虫体内的H3P阳性细胞数量与对照组相比没有明显变化,说明干扰不影响涡虫干细胞的增殖和分裂。原位杂交显示,干扰组涡虫中干细胞marker Djwi A的杂交信号在咽前、耳突后区域显著高于对照组,但干扰组涡虫头部区域的干细胞数量明显少于对照组。再生涡虫中干细胞marker H2B杂交信号模式与整体涡虫中Djwi A的表达一致,杂交信号明显强于对照组,但头部区域的H2B+细胞数量显著少于对照组。q PCR结果显示,干扰后,整体涡虫中的Djwi A的表达量上调了2.8倍,再生涡虫中的H2B的表达量上调了3.4倍。另外,原位杂交结果显示,在对照组再生涡虫中,早、晚期表皮细胞的标志物NB21.11和AGAT阳性细胞在头部区域相对集中,密度较大,而DjAtg1干扰组涡虫头部区域两者的阳性细胞明显少于对照组。由此,我们推测DjAtg1干扰后,可能不影响干细胞的自我更新,但影响干细胞的迁移和分化。（5）RNAseq测序分析RNAi-DjAtg1对涡虫基因表达的影响比对转录组测序的结果显示,干扰DjAtg1引起1041转录本差异表达,其中399个转录本下调表达。Go归类分析表明,下调表达的转录本集中在与细胞粘附、细胞外基质和基质金属蛋白水解酶活性有关。大量文献表明,细胞粘附,细胞外基质和基质金属蛋白水解酶参与调控细胞迁移和细胞分化。因此,推测RNAi-DjAtg1会影响涡虫中细胞的迁移和分化,进而导致涡虫脑神经节再生异常。总结:（1）DjAtg1基因编码的蛋白具有S-TKc功能结构域,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员;（2）DjAtg1基因在涡虫脑神经节表达,干扰DjAtg1导致涡虫脑结构再生异常,说明DjAtg1是涡虫脑神经再生的关键调控因子;（3）RNAi-DjAtg1不影响干细胞的增殖,但影响干细胞的分布模式;（4）转录组测序结果显示,RNAi-DjAtg1引起与细胞的迁移和分化相关基因的下调表达。结论:DjAtg1是涡虫脑神经再生的关键调控因子,干扰DjAtg1可能影响了干细胞的迁移和分化,进而影响了涡虫脑神经节的再生。