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研究目的
炎症性肠炎（Inflammatoryboweldisease，IBD）是一种病因不明的非特异性肠道炎症性病变，主要分为溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis,UC）和克罗恩病（Crohn’sdisease）。UC主要发病部位为直肠与乙状结肠。临床上主要药物治疗有氨基水杨酸制剂，糖皮质激素和免疫抑制剂等。而这些传统药物都缺乏炎症靶向性，将导致机体产生严重的副作用，靶区药物浓度低而无法达到治疗效果等问题。角质成纤维细胞生长因子-2（Keratinocytegrowthfactor-2,KGF-2）具有良好的粘膜修复功能，能够有效地治疗溃疡性结肠炎，然而作为大分子蛋白类药物，KGF-2在体内血液循环中稳定性差，半衰期短，易降解。脂质体是一种已经应用于临床的纳米载体，经中性粒细胞膜嵌合脂质体后，表面具有LFA-1，能够与体内炎症内皮细胞高表达的ICAM-1特异性结合，使脂质体具有主动靶向的作用。本文设计并构建了中性粒细胞膜嵌合脂质体包载KGF-2，并从体外与体内系统地探讨了在肠炎部位的靶向性以及KGF-2对肠炎的治疗效果。
研究方法
1.利用Percoll密度梯度分离法从ICR小鼠全血中提取得到中性粒细胞，并通过瑞氏-吉姆萨染色，流式细胞仪检测，证明提取得到纯度较高的中性粒细胞，再通过超声-离心法得到中性粒细胞膜，通过透射电镜、SDS-PAGE、Agrose-PAGE等表征证明提取得到符合实验要求的中性粒细胞膜。
2.利用逆向蒸发法制备包载KGF-2的脂质体，并通过粒径、电位、透射电镜优化了脂质体与细胞膜的应用比例，通过SDS-PAGE、FT-IR、包封率等测定优化了KGF-2与脂质体的应用比例。
3.通过UV-Vis、KGF-2粒径测定，非还原型蛋白电泳（non-reducedSDS-PAGE）、细胞增殖以及激光共聚焦共定位技术证明细胞膜修饰脂质体包载KGF-2后对KGF-2的活性基本无影响，且增强了其在37℃下的稳定性。
4.通过TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）得到体外炎症模型，加入KGF-Neus共培养后，观察细胞是否对于KGF-2粘附增强。并通过ICAM-1封闭炎症内皮细胞靶点，反向验证靶向通路。
5.通过连续口服DSS诱导ICR小鼠溃疡性结肠炎模型，尾静脉注射FITC-KGF-Neus观察其在体炎症靶向性，并通过α-SMA与ICAM-1免疫荧光染色定位药物在炎症部位的聚集。
6.通过给肠炎模型小鼠连续注射KGF-Neus，以疾病活动指数（DAI）、体重变化、结直肠长度、HE染色对治疗效果进行初步评价，并采用细胞增殖（Ki67）、角蛋白（CK）、Tunel染色观察KGF-Neus是否有促进肠修复并抑制凋亡的作用，采用VEGF、CD31血管共染，巨噬细胞（CD68）、白介素-6（IL-6）染色观察KGF-Neus是否具有缓解炎症，促进血管正常化作用。
研究结果
1.本实验提取得到的中性粒细胞纯度约为70%，经LPS刺激后，成功得到激活的中性粒细胞，经细胞膜提取工艺后，得到粒径为134.44±2.36nm，Zeta电位为-2.38±0.40mV的空心中性粒细胞膜囊泡，经电泳验证无DNA残留。
2.本实验观察到细胞膜与磷脂膜材料比例存在一个饱和的上限，通过筛选得到膜蛋白与磷脂膜材料的最佳比例为1∶50。SDS-PAGE，FT-IR等方法共同证实细胞膜成分存在于脂质体中。通过处方筛选得到KGF-2与材料的最适质量比为1∶1000。
3.通过UV-Vis，KGF-2粒径，非还原型蛋白电泳等测定，发现逆向蒸发法制备KGF-2脂质体对药物活性基本无影响，且能够增强KGF-2在37℃下的稳定性。
4.体外实验中，相较对照组，KGF-Neus增强对TNF-α刺激后炎症型HUVECs的粘附。经ICAM-1抗体封闭后，增强粘附现象消失。
5.FITC-KGF-Neus注射入肠炎模型小鼠体内后，活体成像结果显示药物聚集于肠炎部位。FITC-KGF-Neus与α-SMA、ICAM-1免疫荧光染色结果显示药物聚集在炎症血管处。
6.给予肠炎小鼠KGF-Neus治疗后，疾病活动指数下降，体重增加，结肠长度增加，HE结果显示肠组织结构恢复完整。肠道腺上皮细胞增殖增加，角蛋白分泌增加，凋亡细胞减少，炎症得到缓解，血管趋于正常化。
结论
本论文构建了一种具有肠道炎症微环境靶向的细胞膜嵌合脂质体纳米载体，并成功包载角质成纤维细胞生长因子-2。体外实验证明，KGF-Neus能够靶向炎症内皮细胞表面ICAM-1。体内实验证明，KGF-Neus经静脉注射后，促使KGF-2在肠炎局部浓度提高，加快肠受损上皮的快速修复，促进肠道正常生理功能的恢复。综上所述，仿生型细胞膜嵌合脂质体递送KGF-2为溃疡性肠炎的治疗提供了新思路。
炎症性肠炎（Inflammatoryboweldisease，IBD）是一种病因不明的非特异性肠道炎症性病变，主要分为溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis,UC）和克罗恩病（Crohn’sdisease）。UC主要发病部位为直肠与乙状结肠。临床上主要药物治疗有氨基水杨酸制剂，糖皮质激素和免疫抑制剂等。而这些传统药物都缺乏炎症靶向性，将导致机体产生严重的副作用，靶区药物浓度低而无法达到治疗效果等问题。角质成纤维细胞生长因子-2（Keratinocytegrowthfactor-2,KGF-2）具有良好的粘膜修复功能，能够有效地治疗溃疡性结肠炎，然而作为大分子蛋白类药物，KGF-2在体内血液循环中稳定性差，半衰期短，易降解。脂质体是一种已经应用于临床的纳米载体，经中性粒细胞膜嵌合脂质体后，表面具有LFA-1，能够与体内炎症内皮细胞高表达的ICAM-1特异性结合，使脂质体具有主动靶向的作用。本文设计并构建了中性粒细胞膜嵌合脂质体包载KGF-2，并从体外与体内系统地探讨了在肠炎部位的靶向性以及KGF-2对肠炎的治疗效果。
研究方法
1.利用Percoll密度梯度分离法从ICR小鼠全血中提取得到中性粒细胞，并通过瑞氏-吉姆萨染色，流式细胞仪检测，证明提取得到纯度较高的中性粒细胞，再通过超声-离心法得到中性粒细胞膜，通过透射电镜、SDS-PAGE、Agrose-PAGE等表征证明提取得到符合实验要求的中性粒细胞膜。
2.利用逆向蒸发法制备包载KGF-2的脂质体，并通过粒径、电位、透射电镜优化了脂质体与细胞膜的应用比例，通过SDS-PAGE、FT-IR、包封率等测定优化了KGF-2与脂质体的应用比例。
3.通过UV-Vis、KGF-2粒径测定，非还原型蛋白电泳（non-reducedSDS-PAGE）、细胞增殖以及激光共聚焦共定位技术证明细胞膜修饰脂质体包载KGF-2后对KGF-2的活性基本无影响，且增强了其在37℃下的稳定性。
4.通过TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）得到体外炎症模型，加入KGF-Neus共培养后，观察细胞是否对于KGF-2粘附增强。并通过ICAM-1封闭炎症内皮细胞靶点，反向验证靶向通路。
5.通过连续口服DSS诱导ICR小鼠溃疡性结肠炎模型，尾静脉注射FITC-KGF-Neus观察其在体炎症靶向性，并通过α-SMA与ICAM-1免疫荧光染色定位药物在炎症部位的聚集。
6.通过给肠炎模型小鼠连续注射KGF-Neus，以疾病活动指数（DAI）、体重变化、结直肠长度、HE染色对治疗效果进行初步评价，并采用细胞增殖（Ki67）、角蛋白（CK）、Tunel染色观察KGF-Neus是否有促进肠修复并抑制凋亡的作用，采用VEGF、CD31血管共染，巨噬细胞（CD68）、白介素-6（IL-6）染色观察KGF-Neus是否具有缓解炎症，促进血管正常化作用。
研究结果
1.本实验提取得到的中性粒细胞纯度约为70%，经LPS刺激后，成功得到激活的中性粒细胞，经细胞膜提取工艺后，得到粒径为134.44±2.36nm，Zeta电位为-2.38±0.40mV的空心中性粒细胞膜囊泡，经电泳验证无DNA残留。
2.本实验观察到细胞膜与磷脂膜材料比例存在一个饱和的上限，通过筛选得到膜蛋白与磷脂膜材料的最佳比例为1∶50。SDS-PAGE，FT-IR等方法共同证实细胞膜成分存在于脂质体中。通过处方筛选得到KGF-2与材料的最适质量比为1∶1000。
3.通过UV-Vis，KGF-2粒径，非还原型蛋白电泳等测定，发现逆向蒸发法制备KGF-2脂质体对药物活性基本无影响，且能够增强KGF-2在37℃下的稳定性。
4.体外实验中，相较对照组，KGF-Neus增强对TNF-α刺激后炎症型HUVECs的粘附。经ICAM-1抗体封闭后，增强粘附现象消失。
5.FITC-KGF-Neus注射入肠炎模型小鼠体内后，活体成像结果显示药物聚集于肠炎部位。FITC-KGF-Neus与α-SMA、ICAM-1免疫荧光染色结果显示药物聚集在炎症血管处。
6.给予肠炎小鼠KGF-Neus治疗后，疾病活动指数下降，体重增加，结肠长度增加，HE结果显示肠组织结构恢复完整。肠道腺上皮细胞增殖增加，角蛋白分泌增加，凋亡细胞减少，炎症得到缓解，血管趋于正常化。
结论
本论文构建了一种具有肠道炎症微环境靶向的细胞膜嵌合脂质体纳米载体，并成功包载角质成纤维细胞生长因子-2。体外实验证明，KGF-Neus能够靶向炎症内皮细胞表面ICAM-1。体内实验证明，KGF-Neus经静脉注射后，促使KGF-2在肠炎局部浓度提高，加快肠受损上皮的快速修复，促进肠道正常生理功能的恢复。综上所述，仿生型细胞膜嵌合脂质体递送KGF-2为溃疡性肠炎的治疗提供了新思路。