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阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease AD）是老龄化社会的重要疾病,并成为威胁老年人群健康的四大杀手之一。淀粉样蛋白Aβ在大脑中不断生成和累积,引起显著的淀粉样斑块形成和继发性神经损伤,是AD重要的发病机制。Aβ是由APP（淀粉样蛋白前体）分子病理切割形成的,而β-分泌酶（BACE1）是Aβ生成的主要限速酶,也是AD药物研发和分子机制研究的核心靶点。BACE1通常被认为是由501个氨基酸组成的55KD的蛋白酶,目前大部分的研究也将其作为靶点来进行AD的药物研发,然而多以失败告终,这提示了BACE1分子的复杂性。最新文献报道,BACE1的转录本通过选择性剪接机制可以产生分别编码含有501、476、457以及432个氨基酸的BACE1异构体,分别编码55KD,52KD,49KD和47KD的BACE1蛋白。然而此方面的研究才刚刚开始,各种异构体的功能和形成条件还未见报导。养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司生产的国家三类新药,有很好的改善脑缺血和神经细胞营养作用。本课题组研发了养血清脑颗粒对AD治疗的可能适应症,发现养血清脑颗粒具有显著清除AD模型小鼠大脑β-淀粉样斑块的作用,显著改善AD小鼠的记忆和认知能力。在此基础上,本项目发现,养血清脑颗粒具有调控BACE1的选择性剪接的重要功能,产生一种短型47KD（432个氨基酸）的BACE1亚型分子,我们通过系统地分析不同亚型BACE1的功能,强调了47KD亚型的BACE1对于AD拮抗的生理意义。首先,我们将8月龄APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠连续灌胃给药两个月,给予不同剂量（1/3养血低浓度组,养血低浓度组,养血高浓度组;其中低浓度组为人鼠体表面积换算后的临床用药浓度,高浓度组具有显著的AD治疗作用）的养血清脑颗粒,以生理盐水组为空白对照,安理申（为人鼠体表面积换算后的临床用药浓度）组为阳性对照。取转基因鼠的脑组织作为研究对象,同时选择10月龄正常小鼠作为背景鼠。提取脑组织RNA,并逆转录合成cDNA,我们以识别不同BACE1剪接体设计引物,通过RT-PCR实验和测序,分析了养血清脑颗粒产生的BACE1的属性和可能关联的选择性剪接机制。测序结果显示,正常小鼠组的脑中BACE1的形式为a型（55KD）,生理盐水组和安理申组的AD小鼠脑中BACE1的表达形式为b型（52KD）,无论是1/3养血低浓度组还是养血低浓度组的AD小鼠,BACE1在脑中的表达形式均为c型（49KD）,而在养血高浓度组的AD小鼠脑中出现了d型BACE1（47KD）。Western blot检测也证明高剂量的养血清脑颗粒的AD小鼠脑组织出现大约47KD大小的片段。所以,我们发现并证明了养血清脑颗粒促进BACE1发生选择性剪接,出现47KD的BACE1亚型。接下来,为了确定养血清脑颗粒所诱导产生的47KD的BACE1对Aβ生成是否有影响,我们设计并进行了检测Aβ1-40和Aβ1-42的生成实验。我们以BACE1（55KD）的真核质粒为模板,制备了52KD、49KD和47KD的BACE1真核突变质粒。我们将不同剪接型的BACE1真核质粒与APP野生型或APPSWE突变型共转染到SHSY5Y细胞中,48h后检测了不同BACE1亚型对APP分子切割产生Aβ1-40和Aβ1-42的作用。发现无论是过表达APP野生型还是APPSWE突变型,b型BACE1（52KD）可以促进Aβ1-40和Aβ1-42的生成;而不同于其他三种BACE1亚型,只有d型BACE1（47KD）可以显著抑制Aβ1-40和Aβ1-42的生成,抑制率达到80%以上,提示了47KD的BACE1不同于传统的BACE1对APP病理切割和Aβ形成的促进作用,其具有APP病理切割的拮抗作用和Aβ形成的抑制作用。然后,我们通过质粒注射的方法,研究了不同BACE1亚型对AD小鼠学习记忆和脑内Aβ淀粉样斑块形成的影响,以揭示BACE1亚型的体内作用。我们选择16月龄的AD小鼠,正常饲养设置五组,每组6只实验鼠,雌雄各半,包括空白组（空载体组）、a型BACE1（55KD）组、b型BACE1（52KD）组、c型BACE1（49KD）组和d型BACE1（47KD）组。每组分别腹腔注射高纯度的质粒,每周两次,每次每只20ug质粒;8周后通过行为学实验检测每组模型鼠的学习记忆能力,同时我们将行为学实验后的小鼠鼠脑进行包埋固定,三种特异性识别BACE1不同亚型的抗体进行免疫组化,验证腹腔注射质粒在AD小鼠脑内可以正常表达。我们通过小鼠行为学实验检测了不同BACE1亚型对APPswe/PS1dE9转基因AD模型鼠学习和记忆的影响。Y迷宫实验结果显示,与空载体对照组和其他三种BACE1亚型相比,d型BACE1（47KD）过表达的转基因鼠的Y迷宫路径认知准确率显著上升,说明d型BACE1（47KD）过表达可以增强转基因鼠APPswe/PS1dE9的短期学习记忆能力。Morris水迷宫的实验结果显示,与空白组和其他三种BACE1亚型相比,47KD亚型的BACE1组的小鼠找到隐匿于水中平台所走的路程较短,各组小鼠找到隐匿平台所需的时间（潜伏期）呈缩短趋势。在第7天撤去水中隐匿平台,小鼠进行空间探索实验在水中寻找原平台的位置,与其他各组相比,47KD亚型BACE1组的AD小鼠多次经过原平台位置,且多在原平台所在的象限活动,说明47KD亚型的BACE1能够加深小鼠对平台的位置的长期记忆,即对阿尔茨海默症的长期记忆认知损伤的恢复作用显著。以上结果说明,47KD亚型BACE1能够改善小鼠的短期和长期记忆和认知,不仅不同于其他BACE1亚型,而且优于空载体对照组,说明47KD亚型BACE1具有显著地AD记忆认知的校正作用。最后,我们通过三种病理学方法检测了不同BACE1亚型对AD鼠脑内Aβ淀粉样斑块形成的影响,结果显示,无论是硫黄素S、刚果红还是Aβ1-16抗体免疫组化染色,在空载体对照组和其他三种BACE1亚型注射的AD鼠脑内,均可检测到显著的Aβ淀粉样斑块累积,而在47KD亚型BACE1注射组,脑内Aβ淀粉样斑块不仅显著低于其他BACE1亚型组,而且显著低于空载体对照组,说明47KD亚型BACE1显著减少和纠正AD鼠脑内β-淀粉样斑块的形成和沉积。综上所述,我们从蛋白水平和分子水平证明了养血清脑颗粒可以促使BACE1发生选择性剪接,且以47KD的形式存在;同时,发现不同于其他三种BACE1亚型分子（55KD、52KD、49KD）,d型BACE1（47KD）可以显著抑制Aβ1-40和Aβ1-42的生成,同时发现b型BACE1（52KD）可以促进Aβ1-40和Aβ1-42的生成;然后我们分别从行为学和病理学上确定d型BACE1（47KD）可以提高小鼠的记忆认知能力,减少AD小鼠脑内Aβ的产生。通过以上的研究基本确定47KD的BACE1是养血清脑颗粒改善小鼠认知能力的重要分子靶点之一,发现了一种养血清脑颗粒调节BACE1选择性剪接而清除AD鼠脑内Aβ淀粉样斑块的新型分子机制,为AD的药物研发提供依据。