【摘 要】
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非蛋白质氨基酸作为手性结构单元、可用于制备多种药物分子,在医药、农药、食品等行业中发挥着重要作用。相比于化学合成和手性拆分,酶催化不对称合成制备手性非蛋白质氨基酸,具有立体选择性严格、反应条件温和以及过程绿色等优点,是一种潜在的优势方法。利用NADH依赖型谷氨酸脱氢酶（GDH）催化酮酸生成相应的非蛋白质氨基酸具有过程简单高效、酶来源广泛、辅酶成本低等优势,但是也存在底物谱窄、催化效率低、产酶水平差
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非蛋白质氨基酸作为手性结构单元、可用于制备多种药物分子,在医药、农药、食品等行业中发挥着重要作用。相比于化学合成和手性拆分,酶催化不对称合成制备手性非蛋白质氨基酸,具有立体选择性严格、反应条件温和以及过程绿色等优点,是一种潜在的优势方法。利用NADH依赖型谷氨酸脱氢酶（GDH）催化酮酸生成相应的非蛋白质氨基酸具有过程简单高效、酶来源广泛、辅酶成本低等优势,但是也存在底物谱窄、催化效率低、产酶水平差等问题。本文对野生型GDH进行基因挖掘和筛选,构建了包含7种NADH依赖型GDH的小型酶库。通过比较重组酶的可溶性表达水平以及对天然底物（α-酮戊二酸）的催化活力等指标,获得了性能优良的来源于Clostridium difficile 630的谷氨酸脱氢酶CdGDH。基于多序列比对,确定了 CdGDH两个活性中心突变热点,经过定点突变获得了对非天然模式底物2-羰基-4-（羟基甲基膦酰基）丁酸（PPO）具有催化活力的突变酶,其中优势突变体CdGDH-A145G粗酶酶活以及比酶活分别达到1.64 U/mL和9.68 U/mg。对CdGDH-A145G进行酶学性质表征,其最适反应pH为7.5,最适反应温度为50℃。为进一步提高CdGDH对PPO的催化活力,对影响谷氨酸脱氢酶催化活力的“铰链”区域进行定点饱和突变。针对CdGDH-A145G构建了 1个单点和2个双点饱和突变文库,酶活均有显著提高。其中三点突变体 CdGDH-A145G/T99V/I101Y的酶活最高,粗酶酶活达到10.65 U/mL,比酶活57.11 U/mg,分别是单点突变体CdGDH-A145G的6.66倍和5.9倍,证明非活性中心的“铰链”区域是对CdGDH酶活影响较大的敏感区域。测定了这些突变体的底物特异性,发现突变体对多种非蛋白质氨基酸均具有更好的催化活力。随后对三点突变体CdGDH-A145G/T99V/I101Y再进行随机突变,发现G72同义突变效果最好,获得的四点突变体CdGDH-A145G/T99V/I101Y/G72G粗酶酶活达到15.6 U/mL,是随机突变前的1.46倍。对四点突变体进行了酶学性质表征和产酶条件优化。结果表明其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5,45℃下酶活半衰期为161.16 h。通过单因素方法对培养基进行了优化,确定最优碳源为甘油,最优氮源为安琪酵母粉。最优条件下粗酶活力可达19.8 U/mL,约为优化前的1.27倍。除了直接筛选、改造NADH特异性谷氨酸脱氢酶之外,将酶活高、底物谱广的NADPH特异性谷氨酸脱氢酶逆转成NADH特异性也是一种可选方法。因此,本文选取实验室先前研究的来源于Pseudomonas putida的NADPH特异性谷氨酸脱氢酶 PpGDH,通过在线工具 Cofactor Specificity Reversal-Structural Analysis and Library Design尝试对PpGDH进行辅酶特异性逆转,获得了突变体D264V,以NADH为辅酶,酶活达到0.65 U/mg,其对NADH的偏好性较起始酶蛋白增强了 1607倍。
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