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目的:在建立人类多发性硬化(multiple sclerosis,MS)动物模型一实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephlomyelitis,EAE)的基础上,探索骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)影响EAE的作用机制,了解骨髓基质干细胞调节免疫系统作用的主要影响因素;通过体内、体外实验研究BMSC的免疫调节作用,为以后干细胞治疗的临床应用奠定基础。
方法:分离、纯化、培养、鉴定BMSC。用MBP68-86多肽与弗氏佐剂、结核菌素的混合液免疫Lewis大鼠,建立EAE动物模型。体外实验:在发病高峰取材淋巴结T细胞,以不同比例与BMSC共培养,同时加入细胞因子TGF-β与IL-6的单克隆中和抗体,共培养后应用增殖实验检测T淋巴细胞增殖情况,ELISA方法检测培养上清中细胞因子的表达量,流式细胞仪检测调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)与Th17细胞所占细胞百分比;体内实验:淋巴细胞不同比例共培养后进行尾静脉回输T淋巴细胞(107个细胞/只),建立过继免疫EAE动物模型,并于发病高峰期组织取材。通过临床评估、免疫组化等方法检测临床评分及淋巴细胞浸润情况,探讨BMSC对EAE的治疗作用。
结果:骨髓基质干细胞治疗作用研究:1、1:10(BMSC:MBP特异性T淋巴细胞)共培养条件下淋巴细胞增殖实验,BMSC共培养组与对照组相比,T淋巴细胞对MBP68-86的反应性明显减弱(P<0.01);2、流式细胞仪检测MBP特异性T淋巴细胞亚群变化,混合共培养的T淋巴细胞中,CD4+Foxp3+Tregs表达量明显增高,而CD4+IL-17+Th17细胞所占比例下降;3、与对照组相比,BMSC共培养组过继免疫大鼠的临床症状出现时间推迟到第7天,而对照组是从第6天开始发病,比较2组的平均分,BMSC共培养组明显低于对照组(P<0.05)。
骨髓基质干细胞双向调节作用:1、淋巴细胞增殖实验:与对照组相比,高比例(BMSC:MBP特异性T淋巴细胞1:10与1:50)BMSC共培养后的T淋特异性T淋巴细胞1:100)BMSC共培养后的T淋巴细胞对MBP68-86的反应性反而增加;2、Elisa检测不同比例培养后上清液:与对照组相比,在1:10共培养组中IFN-γ,IL-17表达量下降(P<0.05),而IL-4,TGF-β和IL-6表达量上升(P<0.01)。而在1:100共培养组中IFN-β下降(P<0.05),IL-17和IL-6表达量上升(P<0.01),IL-4,TGF-β表达量无显著性差异;3、流式细胞仪检测:1:10共培养组中Treg细胞增多而Th17细胞减少,加入TGF-β的单克隆抗体可以逆转干细胞的调节作用。1:100共培养组中Th17细胞增多,但对Treg细胞无明显调节作用,TGF-β或IL-6的单克隆抗体都使得Th-17细胞减少;4、过继免疫评分:1:10共培养组发病较对照组明显减轻,加入TGF-β的单克隆抗体可以逆转干细胞的调节作用使发病加重。1:100共培养组发病较对照组重,TGF-β或IL-6的单克隆抗体都使得发病缓解。
结论:1、骨髓基质干细胞调节EAE的效果与剂量密切相关,在不同比例条件下表现出不同的调节效果,高比例条件下呈抑制作用,低比例条件下则呈加重作用。2、高比例骨髓基质干细胞共培养大幅上调了TGF-β的表达量,从而抑制特异性T淋巴细胞增殖,降低炎性细胞亚群Th17的比例,提高保护性细胞亚群Treg的比例,进而缓解AT-EAE动物模型发病情况。3、低比例骨髓基质干细胞共培养表达少量的TGF-β及IL-6,提高了炎性细胞亚群Th17的比例,进而加重AT-EAE动物模型发病情况。