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目的:肾癌是泌尿系统最常见的恶肿瘤之一,在人类癌症的发病率中居第九位。病因极其复杂,既有内在的遗传因素,又有外在的环境因素。长期吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗是较明确的致病因素。肾癌的发病率呈逐年上升的趋势,但死亡率亦呈明显的上升趋势,究其原因是其发生发展的机制尚不明确。肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)又称肾腺癌,简称为肾癌,占所有肾脏恶性肿瘤的80%-90%。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)占所有RCC病例的85%,是RCC中最常见而且比较有侵袭力的一个亚型。非编码RNA是一类广泛存在人体细胞内且不能翻译成蛋白质的RNA。其中长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)和短链微小RNA(micro RNA,miRNA)已被证实与癌症发源进展密切相关,尤其是LncRNA与miRNA之间的相互作用近年来已经成为肿瘤发生发展机制研究的热点。但非编码RNA对RCC的调控机制仍不明确。因此,本研究通过探索LncRNA/miRNA/靶基因的信号通路在ccRCC发生发展中的作用机制,以期为肾癌的诊断与治疗提供新的思路及依据。研究方法:1、肾透明细胞癌中拟研究LncRNA的确定及其在癌及癌旁组织中的表达情况通过ENCORI,GEPIA,TCGA等在线数据库对拟研究的LncRNA SNHG12进行检索,查看数据库中其在ccRCC中的表达情况及患者的生存情况,并综合文献确定了拟研究的LncRNA。从实验室标本库中选取90例病理明确诊断为ccRCC的成对的癌及癌旁组织,提取组织RNA,SNHG12在ccRCC及癌旁组织中的表达水平差异通过q RT-PCR检测。根据SNHG12在ccRCC中的表达情况将其分为高表达组和低表达组,分析两组与临床特征之间的关系,进一步明确SNHG12在ccRCC中的意义。2、SNHG12在肾透明细胞癌细胞系中的功能验证培养多个细胞系的ccRCC细胞,分别提取各个细胞系的RNA,通过q RT-PCR技术检测不同细胞系SNHG12的表达量,选取表达量高的两个细胞系进行转染等相关实验。将siRNA转染两个细胞系,观察下调SNHG12后,ccRCC细胞增殖和迁移能力的变化。3、与SNHG12相互作用miRNA的筛选、检测及二者相互作用的验证通过Lnc ACTdb2.0、Target Scan、DIANA等在线数据库,查找与LncRNA SNHG12相互作用的miRNA。并通过ENCORI、GEPIA、TCGA等在线数据库对miRNA进行检索,查看数据库中其在ccRCC中的表达情况及患者的生存情况,并综合文献最终确定拟研究的miRNA。再次使用之前实验室标本库中选取的成对的ccRCC的癌及癌旁组织,提取组织RNA,miRNA在ccRCC及癌旁组织中的表达水平差异通过q RT-PCR技术检测。并通过相关性分析明确SNHG12与miRNA之间的相关性。通过Target Scan、Lnc ACTdb2.0等在线数据库,预测SNHG12与miRNA之间的靶向靶点。通过结合实验,验证二者的结合。同时也揭示了SNHG12作为内源竞争性RNA,通过海绵吸附作用,特异性结合miRNA,抑制miRNA的功能,间接上调m RNA,促进了蛋白的表达,增进了肿瘤发生发展。4、下游靶基因的筛选及SNHG12、miRNA对靶基因调控机制的验证通过Lnc ACTdb2.0、Target Scan、DIANA等在线数据库,查找下游靶基因。并通过ENCORI、GEPIA、TCGA等在线数据库对下游靶基因进行检索,查看数据库中其在肾透明细胞癌中的表达情况及患者的生存情况,并综合文献最终确定拟研究的下游靶基因。下调SNHG12、上调miRNA,下游靶基因蛋白水平的变化情况通过Western Blot技术进行检测。通过Target Scan、Lnc ACTdb2.0等在线数据库,预测miRNA与下游靶基因m RNA的靶向靶点。通过结合实验,验证二者的结合。通过设计Western Blot回复实验进一步验证SNHG12、miRNA对下游靶基因的调控;通过设计Ed U回复实验明确SNHG12、miRNA对下游靶基因表达的调控后对ccRCC细胞增殖能力的影响;通过设计Transwell回复实验明确SNHG12、miRNA对下游靶基因表达的调控后对ccRCC细胞迁移能力的影响。5、裸鼠成瘤实验对SNHG12、miRNA及靶基因之间相互调控的进一步验证通过裸鼠异种移植瘤体内实验,观察不同处理方法,移植瘤的生长情况,进一步验证SNHG12、miRNA对靶蛋白的调控作用。并将移植瘤的瘤体组织进行免疫组织化学检测,进一步验证SNHG12、miRNA对下游靶基因表达的调控后对ccRCC细胞增殖能力的影响。结果:1、通过数据库中目的LncRNA在ccRCC及癌旁组织中表达量的意义及生存分析,结合文献,最终将SNHG12确定为待研LncRNA。数据库中,SNHG12在ccRCC组织中呈高表达。生存分析显示,SNHG12表达量的高低与病人总生存时间有关。SNHG12表达量越高,病人总生存时间越短。提取实验室标本库中90例病理明确诊断为ccRCC成对的癌及癌旁组织的RNA,q RT-PCR检测SNHG12的表达量,发现与癌旁组织相比,SNHG12在ccRCC组织中的表达量明显增高,验证了数据库中的信息。随后进行了ccRCC中SNHG12表达量的高低与临床特征之间的相关性分析,发现SNHG12表达量的高低与性别、年龄和肿瘤分期(TNM分期)无关,但与病理核分级相关,ccRCC中SNHG12表达量越高,核分级越高,恶性程度越高,肿瘤本身更容易发生局部的侵袭、远处的转移及复发。2、培养786-O、769-P、OSRC-2、CAKI-1、ACHN五个ccRCC细胞系细胞,分别提取各个细胞系细胞的RNA,通过q RT-PCR技术检测不同细胞系细胞中SNHG12的表达量,发现769-P、OSRC-2两个细胞系细胞中SNHG12含量相对较高,因此将这两个细胞系作为后续的研究对象。将SNHG12 silencer转染两个细胞系,观察下调SNHG12后,细胞增殖及迁移能力的变化。Ed U增殖实验显示下调SNHG12后两个细胞系细胞的增殖能力减弱。Transwell实验显示下调SNHG12两个细胞系细胞的迁移能力减弱。3、通过数据库筛选,并根据生存分析及相关性分析,再结合文献最终确定miR-30a-3p为与SNHG12相互作用的miRNA。数据库中,miR-30a-3p在ccRCC中低表达。生存分析显示,miR-30a-3p表达量的高低与病人的总生存时间有关。miR-30a-3p表达量越低,病人的总生存时间越短。提取实验室标本库中72例病理明确诊断为ccRCC成对的癌及癌旁组织的RNA,q RT-PCR检测miR-30a-3p的表达量,与癌旁组织相比,miR-30a-3p在ccRCC组织中呈低表达,验证了数据库中的信息。进一步对SNHG12与miR-30a-3p在对应癌组织中表达量的相关性进行分析,结果显示二者呈负相关。通过网站预测二者可能的结合位点,构建质粒,转染769-P、OSRC-2两个细胞系,通过双荧光素酶报告基因实验发现,共转染miR-30a-3p和野生型SNHG12报告基因质粒组的荧光强度最低,证实了SNHG12与miR-30a-3p可发生特异性结合。4、通过数据库筛选并根据生存分析及表达相关性分析再结合文献最终确定RUNX2为下游的靶蛋白。数据库中,RUNX2在ccRCC组织中呈高表达。生存分析显示,RUNX2表达量的高低与病人总生存时间有关。RUNX2表达量越高,病人总生存时间越短。有研究明确指出RUNX2在RCC中高表达,通过诱发上皮间充质转化,促进了肾癌的进展。下调SNHG12后,RUNX2蛋白表达水平下降。通过网站预测miR-30a-3p与RUNX2基因3’UTR区可能的结合位点,构建质粒,转染两个细胞系,通过双荧光素酶报告基因实验发现,共转染miR-30a-3p和野生型RUNX2报告基因质粒组的荧光强度最弱,证实了RUNX2与miR-30a-3p可发生结合。为了进一步验证二者的调控关系,上调miR-30a-3p,RUNX2蛋白表达水平下降。Western Blot回复实验结果显示下调SNHG12后RUNX2蛋白表达量下降,但同时沉默miR-30a-3p,则部分逆转了单纯下调SNHG12对RUNX2蛋白表达的抑制作用。有报道称IGF-1R和WNT2直接受miR-30a-3p调控,在ccRCC中作为癌基因,促进肾癌的进展。因此,回复实验中我们也同时检测了IGF-1R和WNT2蛋白的变化情况,二者的蛋白变化趋势与RUNX2相同。Ed U回复实验结果显示下调SNHG12抑制了ccRCC细胞的迁移能力,但同时沉默miR-30a-3p部分逆转了单纯下调SNHG12对ccRCC细胞增殖能力的抑制作用。Transwell回复实验结果显示下调SNHG12抑制了ccRCC细胞的迁移能力,但同时沉默miR-30a-3p部分逆转了单纯下调SNHG12对ccRCC细胞迁移能力的抑制作用。以上实验结果说明,SNHG12、miR-30a-3p可通过上调RUNX2等多种癌基因水平,进而促进ccRCC细胞的增殖和迁移能力。5、裸鼠移植瘤实验结果显示,SNHG12-KD组与对照组相比,下调SNHG12显著抑制了移植瘤的生长,而同时沉默miR-30a-3p可以部分逆转单独下调SNHG12对移植瘤生长的抑制作用。随后我们进行了免疫组化实验,结果显示,下调SNHG12有效地抑制了小鼠体内肿瘤中Ki-67的阳性率,而同时沉默miR-30a-3p部分逆转了单独下调SNHG12对Ki-67阳性率的抑制作用。以上实验结果说明,SNHG12、miR-30a-3p可通过调控RUNX2的表达进而促进ccRCC细胞的增殖能力。结论:SNHG12在ccRCC中高表达,起到促癌作用;miR-30a-3p在ccRCC中低表达,起到抑癌作用。SNHG12作为内源竞争性RNA,发挥“海绵吸附”作用,特异性结合miR-30a-3p,抑制miR-30a-3p的功能,间接上调RUNX2等癌基因的表达,促进了ccRCC细胞的增殖与迁移。