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[目的]肾脏缺血再灌注损伤（RIRI）是指在肾脏手术、肾移植过程中,常不可避免的中止肾脏血供,当操作完毕肾脏循环恢复后,肾组织、细胞损伤无减轻反而进一步加重的病理现象。在RIRI中,肾小管上皮细胞是损伤最严重的细胞类型,当损伤较重或多次时,肾小管上皮细胞的适应不良性修复可造成肾脏纤维化,引起肾功能障碍,缩短移植肾存活时间。大量研究认为,肾小管上皮细胞的适应不良性修复与细胞的周期停滞和上皮间充质转化（EMT）相关,但具体机制仍不清楚。铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡形式,依赖于铁和脂质过氧化物的累积。最近的研究提示了铁死亡和肾缺血再灌注损伤之间关系密切。但目前关于铁死亡在肾损伤后修复过程中作用的研究较少,肾脏I/R后适应不良性修复过程中肾小管上皮细胞的铁死亡变化情况暂未见报道,需要我们进一步研究。因此,本研究首先利用生物信息学分析方法筛选既与远期移植肾失功相关又同时与铁死亡相关的差异表达基因,建立风险预后模型用于预测远期移植肾失功风险。然后利用细胞模型和动物模型对选出基因进行进一步检测筛选,综合分析后将p21列为研究目标。继而探索p21影响RIRI后适应不良性修复的作用和机制,并观察这一过程中铁死亡的变化特点。意图为将来以p21为靶点治疗肾脏适应不良性修复提供理论依据,可能有利于延长移植肾使用时间。[方法]1.从GEO数据库中选择并下载人类全基因组测序数据集,通过综合生物信息学分析,建立一个铁死亡相关基因的风险预测模型,用于预测远期移植肾失功风险。2.建立大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）缺氧/复氧（H/R）模型和大鼠肾脏缺血再灌注（I/R）模型,并设计Erastin诱导铁死亡和Fer-1回复铁死亡实验,用于对比验证细胞H/R模型和动物肾I/R中存在铁死亡;通过检测SLC7A11、GPX4、ACSL4的表达,CCK-8检测细胞活力,评估肾小管上皮细胞铁死亡情况;通过肾功能、组织病理学改变评估肾脏损伤程度;通过RT-qPCR检测风险模型中6个铁死亡相关基因的表达情况,并对基因进行进一步筛选。3.在第二部分建立的细胞模型和动物模型的基础上,利用shp21慢病毒感染细胞或大鼠,分多个时间点对比观察p21对肾小管上皮细胞损伤后修复的作用;在损伤后短时间节点,通过检测铁死亡相关指标、电镜观察细胞内线粒体变化,CCK-8和TUNEL检测细胞损伤情况、肾功能和组织病理学改变评估p21是否通过抑制铁死亡保护肾小管上皮细胞;在长时间节点,增加对Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin、TGF-β、CDK、PCNA的检测评估p21对细胞周期、细胞增殖、EMT、TGF-β1/smad3通路的作用,分析p21对肾I/R后适应不良性修复的作用。4.通过siCDK2、siSmad3对感染shp21慢病毒的肾小管上皮细胞进行干预,WB检测p21、CDK2、Smad3、E-cadherin、α-SMA等的表达情况,进一步揭示p21通过CDK2/Smad3信号通路正向调控肾小管上皮细胞EMT。[结果]1.首次建立了一个由铁死亡相关基因构成的预测移植肾失功风险的基因模型,包括 GABPB1、CDKN1A（p21）、TLR4、CXCL2、CAV1 和 RRM2。COX分析发现移植肾是否发生排斥反应并不影响移植肾的长期存活。另外,通过GSEA我们发现这6个基因主要富集到细胞形态发生、胚胎发育、酶联受体介导的信号通路等多个信号通路。2.建立了 NRK-52E细胞模型和大鼠肾IRI模型,并证明了 H/R和I/R损伤通过增加肾小管上皮细胞对铁死亡的敏感性引起细胞死亡,导致组织损伤。并且通过在细胞和动物模型中检测基因模型中6个铁死亡相关的基因的表达量,筛选出铁死亡相关基因p21。p21在H/R模型、Erastin诱导铁死亡细胞模型、大鼠肾脏I/R模型中显著增加,且在使用铁死亡抑制剂Fer-1后p21表达明显下调。初步证明p21的表达与铁死亡相关。3.在H/R和I/R后,p21参与多个生物过程:（1）损伤早期,在H/R细胞模型中,敲低p21使细胞活力降低,SLC7A11、GPX4降低,ACSL4升高,电镜下线粒体萎缩明显;大鼠肾I/R模型中,敲低p21使肾小管中SLC7A11、GPX4降低,ACSL4升高,TUNEL显示肾小管上皮细胞死亡增多,肾功能、肾脏组织病理学损伤重,说明在H/R和IRI早期,p21通过抑制铁死亡保护肾小管上皮细胞。（2）损伤之后修复过程中,在H/R细胞模型中敲低p21使CDK2、CDK4升高,流式细胞仪检测发现停滞于G1期的细胞比例减少;在大鼠肾I/R模型中敲低p21使PCNA表达更高,CDK2水平升高,肾功能、肾脏组织病理学损伤减轻,说明p21的升高引起了肾小管上皮细胞的周期抑制和细胞分裂增殖减少,减慢了肾脏I/R后的修复。（3）损伤之后修复过程中,在H/R细胞模型中,敲低p21使Smad2、Smad3的核内蛋白表达降低,α-SMA蛋白表达降低,E-cadherin含量显著升高,TGF-β水平降低。shp21处理的大鼠肾IRI模型中,敲低p21使TGF-β水平降低,Smad3核内蛋白和α-SMA蛋白的表达更低,E-cadherin蛋白的表达更高,Masson染色显示肾小管上皮细胞外基质沉积减少,说明p21的升高促进了肾小管上皮细胞EMT,导致肾脏IRI后适应不良性修复的发生。（4）损伤之后修复过程中,在H/R细胞模型中,敲低p21使细胞活力增加,SLC7A11、GPX4表达增加,ACSL4表达降低,电镜下线粒体萎缩较轻;大鼠肾I/R模型中,敲低p21使肾小管中SLC7A11、GPX4表达增加,ACSL4表达降低,TUNEL显示肾小管上皮细胞死亡减少。说明p21的高表达增加了肾小管上皮细胞对铁死亡的敏感性,可能与肾小管上皮细胞EMT和适应不良性修复相关。4.使用siCDK2或siSmad3对转染shp21的NRK-52E细胞进行干扰:敲低p21后CDK2表达增加、Smad3的入核减少、α-SMA表达降低、E-cadherin表达增加;siCDK2减弱了 shp21抑制EMT的效果;而siSmad3增强了 shp21抑制EMT的效果。说明p21通过CDK2/Smad3信号通路正向调节肾小管上皮细胞EMT,引起肾小管适应不良性修复。[结论]1.以铁死亡相关基因建立了风险预测模型,用于预测远期移植肾失功;2.肾小管上皮细胞H/R损伤以及大鼠肾脏IRI和铁死亡关系密切;3.在肾脏I/R早期,p21通过抑制铁死亡减轻IRI;4.p21在I/R后的修复过程中增加了肾小管上皮细胞对铁死亡的敏感性,可能与肾小管上皮细胞EMT以及肾脏适应不良性修复相关;5.p21通过将肾小管上皮细胞阻滞于G1期,抑制肾小管上皮细胞分裂增殖,延缓肾脏IRI的修复;6.p21通过促进Smad3入核导致肾小管上皮细胞EMT的发生,引起肾脏I/R后适应不良性修复;其部分机制为p21通过CDK2/Smad3信号通路促进肾小管上皮细胞EMT。