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甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,尽管多数预后较好,但却是近年来发病率上升最快的肿瘤之一。乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲状腺癌最常见的病理分型,约占全部甲状腺癌的75-85%。micro RNA（miRNA或miR）是一类由内源基因编码、长度约19-23个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过直接降解靶m RNA或者与靶m RNA的3’非编码区（untranslated region,UTR）结合抑制靶m RNA的翻译,参与基因的转录后水平调控。miRNA的表达调控异常与肿瘤的发生发展密切相关。在甲状腺癌中,分别有约32%和38%的miRNA表达水平上调或下调了两倍以上,且不同分型的甲状腺癌,其miRNA表达谱也存在明显的差异。研究表明,miR-204-5p在多种肿瘤中发挥抑癌作用,通过对靶基因的调控抑制细胞的增殖、迁移、侵袭等功能。在PTC中,仅有研究表明miR-204-5p可以通过靶向HMGB1、IGFBP5、BRD4和ZEB1发挥功能,研究尚不充分。目的:本研究通过生物信息学方法及实验验证筛选并确定目标miRNA,即miR-204-5p:通过人群研究验证miR-204-5p在PTC患者血清中的差异表达情况;从血清和组织两个水平分析miR-204-5p的表达与患者临床特征的关系,明确其临床意义;在转录组和蛋白质组两个水平分析miR-204-5p对PTC细胞系基因表达的影响,并研究miR-204-5p及其靶基因对PTC细胞功能的影响,为PTC的发病机制及临床诊疗研究提供科学依据。方法:采用生物信息学方法,分析GEO和Array Express数据库PTC组织中差异表达的miRNA,并利用TCGA数据对结果进行验证,得到验证的miRNA为本研究的候选miRNA,进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）技术在细胞中对其差异表达进行验证,确定本研究的目标miRNA（即miR-204-5p）。采用1:1匹配的研究设计,以40对PTC患者及健康对照为研究对象,且对照按性别、年龄与PTC患者匹配。采集研究对象外周血,通过RT-q PCR检测血清中miR-204-5p的表达水平,验证其在PTC中的差异表达。从血清和组织两个水平分析miR-204-5p的表达水平与患者临床特征之间的关系。其中,血清水平人群包括40例PTC患者,组织样本为58例PTC患者的组织芯片,采用RT-q PCR和原位杂交（in-situ hybridization,ISH）技术检测患者血清和组织中的miR-204-5p表达水平,分析其与患者临床特征的关系。分别采用MTS细胞增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术、wound healing实验、侵袭小室实验来研究miR-204-5p对PTC细胞TPC-1和BCPAP细胞功能的影响;采用转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）和同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）技术分别在转录组和蛋白质组水平研究miR-204-5p对TPC-1细胞基因表达的影响,分析差异表达的基因和蛋白,并进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析;通过9个数据库预测miR-204-5p的靶基因,与转录组和蛋白质组高通量分析结果整合,同时通过实验验证,确定miR-204-5p的靶基因,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-204-5p对靶基因的靶向调控关系;最后分别采用MTS细胞增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术、wound healing实验、侵袭小室实验来研究靶基因对TPC-1和BCPAP细胞功能的影响。通过以上内容探讨miR-204-5p在PTC中的作用机制。结果:1.PTC差异表达miRNA的筛选及验证对GEO和Array Express数据库的3个数据集（GSE73182、GSE57780、E-GEOD-63511）分析发现5个在PTC中低表达的miRNA,即miR-204-5p、miR-7-5p、miR-451a、miR-138-5p和miR-144-3p,TCGA数据库的分析结果同样印证了这5个miRNA的低表达。实验验证结果表明,5个miRNA中,只有miR-204-5p在PTC细胞TPC-1和BCPAP中的表达水平较正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1均显著下调,因此选定miR-204-5p作为本研究的目标miRNA。2.PTC中miR-204-5p差异表达的人群血清学验证与对照组相比,miR-204-5p在PTC患者血清中的表达水平显著下调,较对照组约下调1倍（P=0.01）。经计算,本研究统计学效能为99.84%,说明研究结果可靠。3.miR-204-5p在PTC中的临床意义关联分析结果表明,血清中miR-204-5p的表达水平与PTC患者良性甲状腺肿瘤情况有关,伴发良性甲状腺病变的PTC患者血清miR-204-5p表达水平低于单纯PTC病变患者（P=0.010）;组织中miR-204-5p的表达水平与PTC患者年龄有关,年龄≥45岁的PTC患者组织中miR-204-5p的表达水平高于年龄＜45岁的患者（χ~2=6.551,P=0.016）。4.miR-204-5p对PTC细胞功能的影响TPC-1和BCPAP细胞在转染miR-204-5p mimic 24小时后,与NC组相比,细胞增殖、集落形成、细胞迁移和细胞侵袭能力均受到显著抑制（P＜0.05）,而细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,且TPC-1细胞G0/G1期的比例显著高于对照组（P＜0.05）。5.miR-204-5p对PTC细胞系转录组的影响RNA-seq结果表明,TPC-1细胞转染miR-204-5p mimic 24小时后,共计筛选出差异表达基因2489个,其中,表达上调的基因1182个,表达下调的基因1307个。GO富集分析发现,这些差异表达的基因在生物过程（biological process,BP）子类中最显著富集的是血管形态发生,在细胞组成（cellular component,CC）子类中最显著富集的是细胞前缘、粘着斑、细胞基质黏着连接,在分子功能（molecular function,MF）子类中最显著富集的是钙粘蛋白结合。KEGG富集分析发现了73条显著富集的通路,其中,最显著富集的5个通路分别是肿瘤中的蛋白多糖、粘着斑、人类巨细胞病毒感染、FcγR介导的吞噬作用和肿瘤通路,与甲状腺有关的通路包括甲状旁腺激素的合成、分泌及作用、甲状腺激素信号通路、甲状腺激素的合成和甲状腺癌。6.miR-204-5p对PTC细胞系蛋白质组的影响iTRAQ结果表明,TPC-1细胞转染miR-204-5p mimic 48小时后,共计筛选出差异表达蛋白382个,其中,表达上调蛋白221个,表达下调蛋白161个。对差异表达蛋白进行GO富集分析发现,BP子类中最显著富集的是刺激反应调节,CC子类中最显著富集的是染色质,MF子类中最显著富集的是核小体DNA结合;显著性富集的KEGG通路共计15个,最显著富集的5个通路依次是氧化磷酸化、非酒精性脂肪肝、帕金森氏病、心肌收缩、p53信号通路;共计203个结构域显著富集;所有差异表达的蛋白中,有32.66%为核蛋白,所占比例最高;其次为胞浆蛋白,占21.37%;线粒体蛋白所占比例为12.10%,排在第三位。7.miR-204-5p的靶基因预测筛选采用9个在线数据库对miR-204-5p的靶基因进行预测,共计预测到靶基因4764个,其中,73个基因可以被至少5个数据库预测到;将转录组与蛋白质组高通量分析结果结合,二者均低表达的基因共计32个;将生物信息学预测结果与组学分析结果结合,筛选出miR-204-5p的候选靶基因3个,即AP2A2、AP1S2和ADCY6。采用RT-q PCR技术验证TPC-1和BCPAP细胞转染miR-204-5p mimic后候选靶基因的差异表达情况,结果表明,转染miR-204-5p mimic后,只有AP1S2基因在两株细胞中的表达均是下调的（P＜0.05）。TCGA数据分析结果显示,与miR-204-5p的表达情况相反,AP1S2在PTC组织中的表达水平显著高于对照（P=0.026）,且实验结果表明,AP1S2在BCPAP细胞中的表达约是Nthy-ori 3-1细胞的2.3倍（P=0.008）。双荧光素酶报告基因实验结果证实,miR-204-5p可以与AP1S2基因的3’UTR区结合。综上,选择AP1S2作为本研究中miR-204-5p的靶基因。8.靶基因AP1S2对PTC细胞功能的影响TPC-1和BCPAP细胞在转染si-AP1S2 24小时后,与NC组相比,细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭能力均受到显著抑制（P＜0.05）,TPC-1细胞的集落形成能力同样受到显著抑制（P＜0.05）,且两株细胞G0/G1期的比例均显著高于对照组（P＜0.05）。结论:1.miR-204-5p在PTC组织、细胞和患者血清中均表达下调,提示其在PTC进程中发挥重要作用。2.miR-204-5p在PTC中具有抗肿瘤作用,能够抑制肿瘤细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡。3.AP1S2是miR-204-5p的靶基因,沉默AP1S2在PTC中发挥抗肿瘤效应,包括抑制肿瘤细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,并诱发细胞G1期阻滞。