L-乳酸是一种重要的有机酸,在食品中主要用作防腐剂或酸味剂等。随着科技和生活水平的不断提高,乳酸及其衍生物的用途不断扩展。其中,最引人注目的应用在于合成可生物降解材料—聚乳酸。近年来聚乳酸的出现引领了乳酸消费的新兴领域,致使市场对高光学纯度的L-乳酸需求旺盛。与传统的乳酸生产方法相比,生物膜法因其可简化固定化过程、提高细菌密度、且膜内细菌有着更强的耐受力等优势,被认为是一种最具潜力的乳酸工业化生产工具。纤维膜具有高比表面积和高孔隙率的结构,利于细菌附着,能为细菌提供理想的生存和繁殖的立体空间,是一种理想的生物膜载体。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,LPA)广泛存在于人体肠道及传统的乳酪制品中,是发酵生产L-乳酸的良好菌种。本课题以副干酪乳杆菌在醋酸纤维素纳米纤维膜(Cellulose acetate nanofiber membrane,NCA)表面形成的乳酸菌生物膜为对象,构建乳酸菌生物膜反应器,对其培养条件、菌体活性、稳定性及抗逆性进行探究,最后初步评定其产酸性能。具体研究工作主要围绕以下几个方面展开:1.副干酪乳杆菌生物膜的调控通过比较副干酪乳杆菌在不同纤维膜材料上形成的生物膜,优选出乳酸菌生物膜形成的最佳载体,醋酸纤维素纳米纤维膜;探究了培养时间、接种量及营养物质对醋酸纤维素纳米纤维膜表面乳酸菌生物膜形成的影响。结果显示,生物膜在培养至第三天时,其菌体干重最高,随着时间的延长,生物膜干重处于稳定状态;接种量对生物膜干重无较大的影响;蔗糖和Mg2+对醋酸纤维素纳米纤维膜表面生物膜的形成有一定的促进作用。2、副干酪乳杆菌生物膜结构与生理特性通过多种表征手段对副干酪乳杆菌生物膜的物理化学结构进行表征,其中,采用活菌计数和激光共聚焦显微镜分析方法,对副干酪乳杆菌生物膜内总活菌数和不同层面的活菌率进行研究;采用化学法对胞外聚合物中多糖和蛋白质随时间的变化规律进行定量分析。结果显示,本实验培养的乳酸菌生物膜具有典型的生物膜形态和结构;随着培养时间的增加,生物膜内活菌数虽有下降,但仍维持1012 CFU/g,生物膜底层活菌率普遍低于其内层和表层,但综合生物膜每层平均活菌率始终维持在80%以上;胞外聚合物中多糖和蛋白质的含量均随着生物膜培养时间的增加而增加,其中蛋白质的含量始终高于多糖。3、副干酪乳杆菌生物膜的稳定性及抗逆性通过振荡和超声法对醋酸纤维素纳米纤维膜表面的乳酸菌生物膜进行处理,考察生物膜在材料上的短期稳定性和长期稳定性。采用热处理、酸碱处理和抗生素处理,考察生物膜的抗逆性。实验结果表明,在醋酸纤维素纳米纤维膜上形成的生物膜具有较强的稳定性,同时还具有极强的抗逆特性,在50 ℃、100 ℃、200 ℃、pH 1.2、pH 2、pH 10 以及 0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL三种不同抗生素浓度条件下,均表现出比悬浮状态更强的耐受力,从一定角度证明了本实验中乳酸菌生物膜具有较强对于不良环境的抵抗能力。基于此结果,采用转录组测序法对副干酪乳杆菌生物膜细胞及其悬浮细胞的基因进行表达差异分析。结果显示,副干酪乳杆菌生物膜细胞基因表达模式不同于悬浮细胞,差异基因中的整合酶、多要转运蛋白、细胞分裂蛋白、β-内酰胺水解酶在副干酪乳杆菌生物膜成熟及抗药性作用中发挥关键作用。4、副干酪乳杆菌生物膜反应器发酵生产L-乳酸首先通过摇瓶发酵,对副干酪乳杆菌在醋酸纤维素纳米纤维膜上形成的生物膜和悬浮菌的产酸能力进行对比;再通过构建乳酸菌生物膜反应器,考察初始葡萄糖浓度、发酵液pH及流速对副干酪乳杆菌生物膜生产L-乳酸性能的影响规律,并对其长期发酵稳定进行评价。结果显示,生物膜发酵过程中没有延滞期,产酸效率普遍高于悬浮菌;且当初始葡萄糖浓度为80 g/L、pH为6.5、流速为0.3 L/h时,其L-乳酸产量和转化效率最高;在30天共9批发酵过程中,前7批的L-乳酸平均转化率在75%以上,从第8批开始反应器生产效率略微有所下降。这说明所构建的副干酪乳杆菌生物膜反应器不仅具有较好的L-乳酸发酵性能,而且生产稳定。这一结果为高密度连续发酵生产L-乳酸提供了新思路,也为解决工业生产L-乳酸提供了新方法。