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辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)有效的解决了诸多不孕问题,为广大不孕夫妇带来了福音。据统计,在发达国家每年约有1-3%的新生儿为ART出生儿。辅助生殖技术操作一般认为是相对安全的,但ART技术运用于不孕症的治疗仅30余年,尚缺乏对ART予代生长发育的长期随访和系统评估,近期不少的临床报道认为ART出生儿表观遗传缺陷风险有所增加,因其绝对发病率较低,尚不能得出最终结论。ART可能影响表遗传的调控,特别是印记基因的表达,从而影响胚胎植入、胎盘形成、器官形成和胎儿生长等方面。早期自然流产约占全部认识的15-20%,其发生体现了人类优胜劣汰的一种自我选择方式,减少了畸形儿的出生。部分研究认为,基因印记缺陷影响了早期妊娠的维持。本文采用两种不同的甲基化检测方法,对经ART技术获得妊娠的早期停育绒毛、早孕减胎绒毛及自然受孕早期停育绒毛和自然受孕早孕绒毛中PEG1的甲基化状态进行对比,探讨辅助生殖技术对表观遗传学的影响及印记基因疾病之间可能存在的关系,为进一步评估ART技术的安全性提供依据第一部分应用COBRA对ART早期妊娠绒毛组织中PEG1甲基化状态的研究【研究目的】采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite RestrictionAnalysis,COBRA),检测ART妊娠早孕绒毛及停育绒毛中印记基因PEG1的甲基化状态,并与自然受孕早孕绒毛及停育绒毛进行对照,探讨辅助生殖技术对印记基因PEG1甲基化状态的影响,及印记基因PEG1甲基化状态与早期妊娠胚胎发育的关系。【材料和方法】于2008年5月至2010年1月南方医院妇产科门诊收集ART早期停育绒毛31例;自然受孕早期停育绒毛29例;自然受孕早孕绒毛标本24例;同期于南方医院生殖医学中心收集ART早孕减胎绒毛12例。绒毛标本均为孕6-10周,患者年龄在21-40岁。自然停育患者双方染色体未见异常,无解剖学方面因素,无家族遗传病史。早期停育组病人B超检查提示:胚胎停止发育或停经6周后多次超声提示未见胚芽。无菌状态下收集绒毛标本,提取全基因组DNA。将绒毛基因组DNA行重亚硫酸氢盐处理。将转化后DNA模板行PEG1扩增,引物序列:(Forward, F) 5’-TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTYGGTT-3’及(Reverse,R)5’-CCCAAAAACAA CCCCAACTC-3’。扩增产物在凝胶电泳中检测,不存在非特异性条带的情况下,将PCR产物使用限制性内切酶Taql于65℃中反应3-3.5h。酶切产物行4%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后于凝胶成像系统中观察结果并摄像,并采用labworks4.6图像捕获/分析软件行甲基化的定量分析。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据用均数±标准差((?)±S)表示。组间数量资料比较采用One-way ANOVA;两组间率的比较采用四格表χ2检验。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。【结果】所有检测标本中未出现PEG1完全甲基化(100%)或非甲基化(0%)的情况。ART停育组PEG1甲基化程度波动于39.3-83.7%之间,ART早孕组波动于43.4-56%,自然受孕停育组为38.9-75.4%及自然受孕早孕组42.1-58.3%之间。四组绒毛标本的PEG1甲基化程度不存在统计学差异(P=0.550)。定义自然受孕早孕组的甲基化状态((?)+2S)为正常甲基化范围(39.0-59.0%),比较ART停育组及自然停育组的甲基化异常是否存在差异。其中,ART停育组中7例标本处于异常范围(22.6%),自然停育组同样存在7例的异常(24.1%),两组之间无统计学差异(P=0.887)。【结论】ART技术获得的正常早期妊娠,早期停育及自然受孕早期妊娠、早期停育绒毛均未发现印记基因PEG1存在极端甲基化(100%)或非甲基化(0%)的状况。极端的印记异常可能早在着床前期就影响了胚胎的继续发育,导致了胚胎着床的失败而无法发育至妊娠阶段。考由于COBRA方法只对单个CpG位点进行了研究,其检测的阴性结果并不能完全排除PEG1 DNA发生甲基化的可能性。确应考虑同时采用其它甲基化检测方法进行进一步定量研究。第二部分应用焦磷酸测序定量分析ART早期妊娠绒毛组织中印记基因PEG1甲基化状态【研究目的】采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing),对ART妊娠早孕绒毛及停育绒毛中印记基因PEG1甲基化状态进行定量分析,并与自然受孕早孕绒毛及停育绒毛进行对照,弥补第一部分中Taq1酶切单个位点的不足;检测亚硫酸盐的转化效率。探讨辅助生殖技术对印记基因PEG1甲基化状态的影响,及印记基因PEG1甲基化状态与早期妊娠胚胎发育的关系。【材料和方法】研究对象及绒毛标本处理、DNA提取、基因组DNA重亚硫酸修饰均同第一部分。将修饰后DNA行PEG1扩增,引物序列:(Forward,F) 5’-TYGTTGTTGGTAGTTTGTAYGGTT-3’及(Reverse,R) Biotin-5’-CCCAAAAACAACCCCAACT C-3’,焦磷酸测序引物:5’-GAGGGGGTGTGGTTG-3’。PCR反应需将引物耗尽,且电泳验证不存在非目的条带,无引物二聚体。试样处理,分离DNA单链,采用瑞典Bitoage公司的PSQ96MA行测序反应。取四个检测CpG位点之C/T平均值作为该样本的甲基化值。两个转化位点之平均值为转化效率。并使用转化率对检测甲基化值进行校正。使用精子标本(理论完全非甲基化样本)、卵子标本(理论完全甲基化标本)检测仪器测序效果。用SPSS13.0软件统计数据。数据用均数±标准差((?)±S)及。各组间数量资料比较采用Welch近似方差分析;应用ROC曲线评价了甲基化程度对自然流产发生的预测价值。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。【结果】1、实验使用精子标本(PEG1理论甲基化值0%)、卵子标本(PEG1理论甲基化值100%)作为对照检测测序效果。所检测精子及卵子标本PEG1甲基化值与标本理论值相符合。焦磷酸测序技术测定效果准确可靠。2、亚硫酸盐转化效率波动于89.9-100%;对转化率低于95%的标本采用以下公式进行了校正:实际甲基化值=检测甲基化值-(95-转化率)。在所有绒毛标本中,PEG1甲基化程度波动于42.0-85.3%之间,未出现完全甲基化(100%)或完全非甲基化(0%)的极端情况。四组间的PEG1甲基化程度存在统计学差异(P=0.030),自然早孕组甲基化程度低于自然停育及ART停育组。焦磷酸测序技术对甲基化值测定的敏感性要优于COBRA方法。3、不同受精方式(IVF vs ICSI)来源绒毛组织不存在PEG1甲基化值差异。4、将所有标本分为自然流产与正常早孕两组,绘制甲基化值与流产关系的ROC曲线。ROC曲线下面积为0.684(95%可信区间0.577-0.791),曲线下面积标准误为0.055,P=0.003。绒毛组织中PEG1甲基化程度越高,自然流产发生的风险也就越高。【结论】辅助生殖技术未影响印记基因PEG1甲基化状态的异常发生,可能不会增加与PEG1甲基化状态异常有关疾病的发病风险,但是PEG1甲基化状态异常与早期妊娠胚胎停止发育有关,甲基化程度越高发生自然流产的几率也就越大。提示除遗传学方面的因素外,表观遗传学方面的异常可能是导致胚胎停育的一个重要因素。焦磷酸测序相比COBRA测定敏感性更高,更能有效、准确的对DNA多个甲基化位点进行定量分析。第三部分自然流产绒毛印记基因PEG1甲基化状态与染色体核型相关性分析【研究目的】对自然受孕及ART妊娠的早期自然流产绒毛行染色体核型及PEG1甲基化状态进行分析,了解异常核型与绒毛组织中PEG1甲基化状态的关系,探讨异常核型对绒毛组织中印记基因甲基化状态的影响。【材料和方法】2008年5月~2010年1月间于南方医院妇产科门诊因胚胎停育而行清宫术的患者26例,无菌收集其绒毛组织,送南方医院遗传室行绒毛染色体核型分析,并对该部分绒毛行焦磷酸测序定量分析其PEG1甲基化状态;同时抽取患者静脉血行染色体检查。用SPSS13.0软件统计数据。数量资料结果以均数±标准差((?)±S)表示。各组间数量资料比较采用Welch近似方差分析。设双侧检验,P<0.05为差异有显著性意义。【结果】所有患者静脉血染色体分析均为正常。26例绒毛标本中,1例因标本污染而发生培养失败。对25例成功培养的绒毛细胞行G显带染色体核型分析,胚胎染色体异常发生率为60%(15例),异常核型包括:四体型、三体型、三倍体及嵌合体、倒位等。异常核型组中甲基化波动范围为:43.4-85.3%,正常核型组中为:50-81.8%。两组间PEG1甲基化值不存在统计学差异(F=2.505,P=0.128)。【小结】核型异常组绒毛标本中PEG1甲基化程度为65.6%,正常核型组中为59.5%,两组间的甲基化程度不存在统计学差异,且正常核型组及异常核型组中均可见甲基化极端值的存在,自然流产绒毛中PEG1甲基化程度的升高可能与染色体异常不存在相关性。染色体畸变及印记异常均有可能参与了自然流产的发生。