【摘 要】
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根系构型对陆地植物的生长发育至关重要,侧根在根系构型中扮演重要的角色,而生长素信号途径在侧根形成中起重要作用。SUMO化修饰是一种动态可逆的翻译后修饰途径,最近的研究表明拟南芥ARF7蛋白的SUMO化修饰调控根系的向水性分布。然而,苹果中ARFs被SUMO化的分子机制尚不清楚。本研究以苹果‘嘎拉’、‘王林’愈伤组织和拟南芥等为材料,利用分子生物学技术和遗传分析等手段,揭示了MdSIZ1介导的MdA
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD1000100）； 国家自然科学基金（31772275）； NSFC-山东联合基金重点项目（U1706202）；
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根系构型对陆地植物的生长发育至关重要,侧根在根系构型中扮演重要的角色,而生长素信号途径在侧根形成中起重要作用。SUMO化修饰是一种动态可逆的翻译后修饰途径,最近的研究表明拟南芥ARF7蛋白的SUMO化修饰调控根系的向水性分布。然而,苹果中ARFs被SUMO化的分子机制尚不清楚。本研究以苹果‘嘎拉’、‘王林’愈伤组织和拟南芥等为材料,利用分子生物学技术和遗传分析等手段,揭示了MdSIZ1介导的MdARF8翻译后修饰调控侧根形成的分子机制,主要研究结果如下:1、SUMO E3连接酶MdSIZ1促进苹果和拟南芥的侧根形成。通过发根农杆菌介导转化的方法获得MdSIZ1苹果根系过表达株系（OE1、OE2和OE3）,发现其比对照植株有更多的侧根数目。此外,MdSIZ1拟南芥异位表达株系（OE13、OE19和OE33）比野生型（Col）具有更多的侧根数目和侧根密度。2、利用酵母双杂交（Y2H）实验筛选到与SUMO E2结合酶MdSCE1互作的生长素响应因子MdARF8。Y2H、pull-down和Bi FC实验验证MdARF8与MdSCE1互作,且MdARF8蛋白中的四个结构域对二者的互作是必须的。通过Bi FC、LUC和Co-IP实验证实MdSCE1、MdSIZ1和MdARF8蛋白能够形成MdSCE1-MdSIZ1-MdARF8蛋白复合体,进而通过SUMO化修饰稳定MdARF8蛋白。3、MdARF8的氨基酸全长序列存在两个潜在的SUMO化保守位点,分别是位于第342位和第380位的赖氨酸（Lys）残基,且在不同物种中保守存在。体内和体外SUMO实验表明,MdARF8氨基酸全长序列上Lys342和Lys380是发生SUMO化修饰的关键位点,其中任何一个位点单独突变均不能抑制MdARF8的SUMO化,将两个SUMO位点同时突变则能够消除MdSIZ1对MdARF8的SUMO化。4、MdARF8 SUMO化位点突变不会影响其与MdSCE1的互作和亚细胞定位。体内、体外蛋白降解实验表明MdARF8蛋白SUMO化程度的降低抑制了MdARF8蛋白稳定性,这说明MdARF8蛋白的第342位和第380位赖氨酸残基对其稳定性至关重要。5、根系表型观察发现,siz1-2突变体相比Col有更少的侧根数目和密度,35S::MdARF8-GFP转基因拟南芥株系比Col有更多的侧根数目和密度,而siz1-2/35S::MdARF8-GFP转基因拟南芥株系侧根数目和密度介于Col和35S::MdARF8-GFP转基因拟南芥株系之间。这说明35S::MdARF8-GFP可以恢复siz1-2突变体抑制的侧根数量和侧根密度。这一结果表明At SIZ1位于MdARF8遗传学上游,从而调控侧根的形成。6、35S::MdARF8-GFP可以恢复siz1-2突变体造成的侧根数目和侧根密度减少的表型,而35S::MdARF8K342RK380R-GFP不能,表明MdARF8蛋白第342位和第380位赖氨酸位点的SUMO化修饰,可能对侧根的形成起着重要的作用。MdSIZ1促进35S::MdARF8-GFP拟南芥侧根的表型,而不能促进35S::MdARF8K342RK380R-GFP侧根的表型,表明MdSIZ1介导MdARF8的SUMO化修饰对拟南芥侧根的形成是必须的。7、MdARF8转基因苹果植株的根尖总数量显著高于对照,而MdARF8K342RK380R转基因植株的根尖数量显著减少,说明减少MdARF8的SUMO化修饰抑制了苹果侧根的形成。q RT-PCR结果显示MdGH3.3、MdGH3.4、MdGH3.5和MdGH3.6在MdARF8转基因苹果根中的表达量显著高于对照,而在MdARF8K342RK380R转基因苹果根中的表达量没有变化。这表明MdSIZ1介导MdARF8的SUMO化修饰可能控制生长素下游应答基因MdGH3s的表达,进而影响苹果侧根的形成。综上,本研究结果表明E3连接酶MdSIZ1介导MdARF8的SUMO化修饰调控苹果侧根形成。SUMO E2结合酶MdSCE1可以与生长素响应因子MdARF8相互作用,在MdSCE1参与下,SUMO E3连接酶MdSIZ1能够与靶蛋白形成MdSCE1-MdSIZ1-MdARF8复合物,促进MdSIZ1介导的MdARF8蛋白上第342位和第380位赖氨酸位点的SUMO化修饰,进而调节生长素下游应答基因MdGH3s的表达,从而影响苹果侧根的形成。本研究为揭示SUMO化修饰影响苹果侧根形成的分子机制奠定了理论基础。
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