【摘 要】
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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性条件致病菌,能够引起多种危及生命的急性或慢性感染,也是导致囊性纤维化(Cystic fibrosis,CF)患者病情进一步恶化的主要原因。P.aeruginosa多样的毒力因子和固有的抗生素耐药性给治疗由这种细菌引起的感染带来了巨大的挑战。P.aeruginosa能利用磷脂酰胆碱(PC)降解产生的甘油作为其在CF患者肺部环境生
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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性条件致病菌,能够引起多种危及生命的急性或慢性感染,也是导致囊性纤维化(Cystic fibrosis,CF)患者病情进一步恶化的主要原因。P.aeruginosa多样的毒力因子和固有的抗生素耐药性给治疗由这种细菌引起的感染带来了巨大的挑战。P.aeruginosa能利用磷脂酰胆碱(PC)降解产生的甘油作为其在CF患者肺部环境生长的能源物质,甘油代谢在P.aeruginosa适应CF患者肺部环境方面可能具有重要作用。甘油-3-磷酸(G3P)是甘油的磷酸化产物,可经脱氢反应产生二羟基丙酮磷酸(DHAP)进入中心代谢途径,同时也是细胞膜和贮存脂质合成的关键前体。磷酸化代谢物的过量积累通常是有毒的,已有文献报道G3P过量积累对部分原核生物和真核生物中的生长及生理表型产生负面影响。近年越来越多的研究表明,生理代谢同样与细菌对抗生素的敏感性以及毒力因子的产生密切相关,在细菌代谢途径中寻找药物靶点开发窄谱抗生素,已成为耐药菌防治领域新的研究热点。本论文针对P.aeruginosa中G3P的代谢机制及其毒性作用展开研究,希望可以为开发靶向G3P代谢的窄谱抗生素防治P.aeruginosa导致的感染提供理论基础与数据支持。本论文第二章以P.aeruginosa模式菌株PAO1为研究对象,构建了该菌株中甘油代谢相关基因的突变菌株,揭示了P.aeruginosa中G3P的合成、分解与转运机制。确定P.aeruginosa PAO1中G3P可来源于甘油的磷酸化与DHAP的还原,分别依赖于甘油激酶GlpK和NAD(P)+依赖性G3P脱氢酶GpsA;G3P的分解通过FAD依赖性G3P脱氢酶GlpD催化的G3P脱氢反应进行;胞外G3P可经转运蛋白GlpT转运进入P.aeruginosa PAO1胞内。另外,发现转录调控蛋白GlpR以G3P而非甘油为效应物,通过与glpFK、glpD启动子区域的结合调控P.aeruginosa PAO1中甘油与G3P代谢相关基因的表达。本论文第三章对P.aeruginosa PAO1的各甘油代谢相关基因的突变菌株进行生理表型分析,发现glpD敲除菌株在丰富培养基中的表型发生显著改变。CF患者呼吸道为一富含甘油的环境,进一步研究发现P.aeruginosa PAO1可在优势碳源琥珀酸或葡萄糖存在时共利用甘油,且glpD敲除菌株在琥珀酸/葡萄糖+甘油培养基中存在G3P的胞内胞外积累,生长受到严重抑制,G3P积累导致glpD敲除菌株的绿脓菌素降低,蹭动性和泳动性减弱,对卡那霉素和氧化压力的耐受性降低等,GlpD可能具有作为抗P.aeruginosa感染治疗靶标的潜力。本论文第四章通过序列比对在P.aeruginosa PAO1基因组鉴定出3个假定的G3P磷酸酶:PA0562、PA3172和PA2067,发现过表达PA0562和PA3172有助于缓解G3P积累对P.aeruginosa PAO1生长的抑制,两者的敲除则会强化G3P积累对P.aeruginosa PAO1生长的抑制。对PA0562和PA3172进行外源表达、分离纯化和酶学性质分析,确定 PA0562 和 PA3172 对 G3P 的Km分别是 7.114±1.305 mM、5.634±0.208 mM,Vmax分别是 47.410±4.102 U·mg-1、18.060±0.305 U·mg-1。PA0562 和 PA3172 并非以 G3P 为唯一底物,对葡萄糖-6-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸等磷酸化代谢物同样具有催化活性。综上所述,本论文揭示了P.aeruginosa模式菌株PAO1中G3P的代谢及调控机制,发现G3P异常积累会抑制P.aeruginosa PAO1生长,导致其毒力因子产生减少及对抗生素和氧化压力的耐受性下降;进一步鉴定了两个可以G3P为底物的磷酸酶,证明其在缓解G3P压力中发挥一定的作用。研究结果对于揭示微生物中G3P代谢机制,提出P.aeruginosa导致感染的防治策略具有一定的指导意义。
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