【摘 要】
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生物催化的氧化还原反应在手性化合物的制备中应用广泛,其中很多反应涉及到辅酶NADPH的原位再生。为构建副产物易分离、辅酶再生效率高、具有工业化应用潜力的NADPH再生体系,论文围绕NADPH再生体系的筛选以及NADPH再生酶的异源可溶性表达开展研究,主要研究内容如下:1)根据副产物易分离的特点,选择甲酸脱氢酶、亚磷酸脱氢酶、醇脱氢酶这三种常见的NADPH再生用酶作为研究对象,分别构建小型酶库,筛选
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生物催化的氧化还原反应在手性化合物的制备中应用广泛,其中很多反应涉及到辅酶NADPH的原位再生。为构建副产物易分离、辅酶再生效率高、具有工业化应用潜力的NADPH再生体系,论文围绕NADPH再生体系的筛选以及NADPH再生酶的异源可溶性表达开展研究,主要研究内容如下:1)根据副产物易分离的特点,选择甲酸脱氢酶、亚磷酸脱氢酶、醇脱氢酶这三种常见的NADPH再生用酶作为研究对象,分别构建小型酶库,筛选获得了催化性能最佳的甲酸脱氢酶MycFDG-3M、亚磷酸脱氢酶PtDH-12×-A176R和醇脱氢酶CbADH;分别构建了谷氨酸脱氢酶PpGluDH-3M和辅酶再生酶的双菌双酶耦合催化体系,比较以上三种辅酶再生酶的NADPH再生效率,结果表明醇脱氢酶CbADH的再生效率最高。对CbADH进行酶学性质表征:其最适反应温度为65℃,最适反应pH为9.5。2)为了提高CbADH在E.coli BL21（DE3）菌株中的异源可溶性表达,通过引入诱导型分子伴侣质粒pGro7表达分子伴侣GroES-GroEL,将pET-28a（+）表达的CbADH酶活从2.31 U/mg DCW提高到了 11.18U/mg DCW。进一步考察了另外三种不同的GroES-GroEL与CbADH共表达策略:pET-28a（+）单质粒共表达、基因组强化表达分子伴侣以及组成型pGro7和pET-28a（+）双质粒共表达。结果表明,组成型pGro7和pET-28a（+）双质粒共表达策略的效果最优,其最佳菌株的可溶性表达比出发菌株提高了 8.07倍,酶活达到21.79U/mg DCW,是出发菌株的9.43 倍。3)通过蛋白质工程对CbADH进行改造,在没有分子伴侣强化表达的条件下,提高了 CbADH在E.coli BL21（DE3）菌株中的可溶性表达。基于在线算法的蛋白质一站式设计（PROSS）策略对CbADH进行了多位点突变,其中6点突变菌株CbADH-6M的可溶性表达提高了 18.12倍,酶活达到36.72U/mg DCW,是出发菌株的15.86倍。本论文筛选得到了极具应用潜力的、来源于Clostridium beijerinckii的醇脱氢酶CbADH,并使用分子伴侣共表达策略与PROSS蛋白质工程改造策略提高了 CbADH的异源可溶性表达,提高了以醇脱氢酶为再生酶、异丙醇为辅底物的辅酶NADPH再生体系的效率。
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