【摘 要】
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目的:探讨MG患者调节性T细胞线粒体自噬异常的分子机制,为探索新的MG特异性治疗途径提供理论依据。方法:（1）研究对象选择与处理:选取15例临床确诊的MG患者,抽取外周血30m L,通过密度梯度离心法分出单个核细胞,然后再用CD4+CD25+Treg分离试剂盒从PB MC中分离出Treg细胞。将MG患者的Treg细胞分为不做任何处理的对照组、经CC CP处理培养组、经Cs A处理培养组、经CCCP
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目的:探讨MG患者调节性T细胞线粒体自噬异常的分子机制,为探索新的MG特异性治疗途径提供理论依据。方法:（1）研究对象选择与处理:选取15例临床确诊的MG患者,抽取外周血30m L,通过密度梯度离心法分出单个核细胞,然后再用CD4+CD25+Treg分离试剂盒从PB MC中分离出Treg细胞。将MG患者的Treg细胞分为不做任何处理的对照组、经CC CP处理培养组、经Cs A处理培养组、经CCCP+MHY1485处理培养组、经Cs A+Rap amycin处理培养组,体外培养4小时。（2）用线粒体绿色荧光探针处理各组细胞,通过流式细胞术检测各组线粒体质量受损的细胞比率。（3）将各组细胞用活性氧探针标记,流式细胞术检测各组细胞的平均活性氧水平和活性氧水平正常的细胞比例。（4）各组细胞采用AV+PI染料标记,流式细胞术检测各组细胞中凋亡情况。（5）提取对照组、CCCP组、Cs A组、CCCP+MHY1485组、Cs A+Rapamycin组细胞总蛋白,通过Wes系统检测各组细胞AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平。（6）统计学方法:通过SPSS25.0统计软件进行统计学分析,用均数±标准差（x±s）表示服从正态分布的计量资料,用单因素方差分析进行多组均数比较,采用LSD法进行两两比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:（1）细胞内线粒体质量情况:对照组、CCCP组、Cs A组、CCCP+MHY1485组、Cs A+Rapamycin组线粒体质量水平分别为（24.91±1.67）%、（15.44±1.54）%、（35.67±1.01）%、（28.30±3.42）%、（9.85±1.02）%。与对照组相比,CCCP组线粒体受损细胞所占比例减少,Cs A组线粒体受损细胞所占比例明显增加（P<0.05）;与CCCP组相比,CCCP+MHY1485组线粒体受损细胞所占比例增加（P<0.05）;与Cs A组相比,Cs A+Rapamycin组线粒体受损细胞所占比例减少（P<0.05）。（2）细胞内活性氧水平:对照组平均活性氧水平为（2.36±0.36）×104,活性氧正常的细胞比例为（88.22±0.21）%;CCCP组Treg细胞平均活性氧水平为（1.58±0.27）×104,活性氧正常细胞比例为（91.19±0.61）%;Cs A组平均活性氧水平为（6.98±0.34）×104,活性氧正常细胞比例为（40.58±1.83）%;CCCP+MHY1485组平均活性氧水平为（3.03±0.52）×104,活性氧正常细胞比例为（85.04±0.95）%;Cs A+Rapamycin组平均活性氧水平为（4.27±0.44）×104,活性氧正常细胞比例为（80.91±1.13）%。与对照组相比,CCCP组活性氧水平降低,Cs A组活性氧水平升高（P<0.05）;与CCCP组相比,CCCP+MHY1485组活性氧水平升高（P<0.05）;与Cs A组相比,Cs A+Rapamycin组活性氧水平下降（P<0.05）。（3）细胞凋亡水平:与对照组（9.86±0.21）%比较,CCCP组（4.98±0.49）%细胞凋亡水平降低,Cs A组（16.64±0.77）%细胞凋亡水平升高（P<0.05）;与CC CP组相比,CCCP+MHY1485组（9.63±0.77）%细胞凋亡水平升高（P<0.05）;与C s A组相比,Cs A+Rapamycin组（8.94±0.54）%细胞凋亡水平降低（P<0.05）。（4）各组AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平:与对照组比较,CCCP组AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平降低,Cs A组AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平升高（P<0.05）;与CCCP组相比,CCCP+MHY1485组AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平升高（P<0.05）;与Cs A组相比,Cs A+Rapamycin组AKT和p70s6k的蛋白磷酸化水平降低（P<0.05）。结论:MG患者Treg细胞中AKT、p70s6k磷酸化水平升高。体外调控MG患者Treg细胞不同线粒体自噬状态,AKT、p70s6k磷酸化水平不同。体外调控AKT、p70s6k磷酸化水平,MG患者Treg细胞线粒体质量、活性氧、凋亡状态不同。MG患者Treg细胞线粒体自噬异常可能与AKT、p70s6k磷酸化导致mTOR通路异常激活有关。
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