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目的肺癌在中国的发病率和死亡率均居癌症首位,是亟待解决的重大公共卫生问题。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是肿瘤血行转移的主要机制,作为液体活检“三驾马车”之一,可提示肿瘤转移风险,联合CTCs计数和影像学、病理学、血清学特征参数有助于准确实现癌症的早期筛查、早期诊断、早期治疗,进而改善肺癌患者的五年生存率。该研究以磁性纳米颗粒（Magnetic nanoparticles,MNPs）为分离介质,以A549细胞特异性适配体(Apt A549)为识别分子,分别构建单价适配体(MNPs-Apt A549)捕获探针和基于滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）构建聚多价适配体(MNPs-Ploy-Apt A549)捕获探针,以期实现肺腺癌细胞的高效率捕获和计数,可望用于肺癌的筛查和辅助诊断。方法1.构建单价适配体捕获探针用于肺腺癌细胞捕获首先,将Apt A549通过链霉亲和素与生物素相互作用偶联至MNPs上,构建MNPs-Apt A549捕获探针,对其偶联效率、水合粒径、Zeta电位进行表征。通过激光共聚焦显微镜、光学显微镜、不同数量细胞的捕获效率分析MNPs-Apt A549捕获探针捕获肺腺癌细胞的可行性,优化捕获条件。在优化后的捕获条件下考察MNPs-Apt A549捕获探针的回收率,评价其稳定性。2.构建聚多价适配体捕获探针用于肺腺癌细胞捕获首先,构建扩增多个重复Apt A549序列的RCA体系,通过琼脂糖凝胶电泳验证其可行性并进行条件优化。将连接DNA（LD）通过链霉亲和素和生物素的相互作用偶联至MNPs上,形成MNPs-LD,并对其偶联效率进行表征。通过RCA反应,在MNPs表面形成含有多个Apt A549序列的核酸长链,即MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针,通过水合粒径和Zeta电位进行表征。结合激光共聚焦显微镜、光学显微镜、不同数量细胞的捕获效率分析MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针捕获肺腺癌细胞的可行性,优化捕获条件。在优化后的捕获条件下考察MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针的回收率,评价其稳定性。3.实际样品检测将构建的MNPs-Apt A549和MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针与商品化MNPs-Ep CAM捕获探针在模拟胸腔积液样本中进行捕获性能的比较。并将其用于模拟血液样本和临床外周血样本中肿瘤细胞的富集,通过免疫细胞化学法（Immunocytochemistry,ICC）对肿瘤细胞进行鉴定并计数。结果1.构建单价适配体捕获探针用于肺腺癌细胞捕获（1）捕获探针表征MNPs平均水合粒径为400.4 nm,Zeta电位为-5.610 m V,偶联Apt A549-1和Apt A549-2后平均水合粒径分别增大至448.0 nm和477.3 nm,Zeta电位降低为-29.90 m V和-31.70 m V。表明Apt A549-1和Apt A549-2成功偶联至MNPs,偶联效率分别为84.40%～87.77%和85.62%～86.99%。（2）最优适配体MNPs-Apt A549-1和MNPs-Apt A549-2对A549细胞的平均捕获效率分别为90.50%和49.00%,对CCRF-CEM细胞的平均捕获效率分别为50.42%和43.33%。因此选择Apt A549-1构建MNPs-Apt A549捕获探针。（3）最优捕获条件筛选出的用于构建MNPs-Apt A549的最优Apt A549浓度为400 nmol/L,MNPs-Apt A549与细胞最优孵育时间为40 min,MNPs-Apt A549最优用量为30μL。（4）回收率在50 cells～1000 cells范围内,回收率为73.37%～96.00%,线性方程为y=0.8742x+4.551（y代表捕获的细胞数,x代表加入的细胞数）,R~2为0.9899。即MNPs-Apt A549平均捕获效率为87.42%。2.构建聚多价适配体捕获探针用于肺腺癌细胞捕获（1）滚环扩增体系条件优化RCA产物经琼脂糖凝胶电泳验证了RCA反应的可行性。最优c DNA与连接DNA浓度比为1:1,最优的连接DNA长度为24个碱基,最优的T4 DNA连接酶用量为25 U,最优的phi29 DNA聚合酶用量为10 U,最优的扩增时间为120 min。（2）捕获探针表征连接DNA与MNPs的偶联效率在82.16%～86.30%之间,表明连接DNA已偶联至MNPs。MNPs的平均水合粒径为413.1 nm,Zeta电位为-5.750 m V;偶联Apt A549后MNPs平均水合粒径增大至441.6 nm,Zeta电位降低为-28.80 m V,RCA扩增后的MNPs平均水合粒径增大至611.6 nm,Zeta电位降低为-52.60 m V,表明MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针已成功构建。（3）最优捕获条件筛选出的最优MNPs-Ploy-Apt A549与细胞孵育时间为80 min,最优MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针用量为30μL。（4）回收率在50 cells～1000 cells范围内,回收率为71.03%～93.67%,线性方程为y=0.8006x+11.21（y代表捕获的细胞数,x代表加入的细胞数）,R~2为0.9727。即MNPs-Ploy-Apt A549平均捕获效率为80.06%。3.实际样品检测MNPs-Apt A549和MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针的平均回收率均高于商业化MNPs-Ep CAM捕获探针,MNPs-Ploy-Apt A549相比于MNPs-Apt A549具有较高的捕获纯度。在临床样本检测中,MNPs-Apt A549和MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针在健康人外周血中均未检出CTCs;在2例肺腺癌患者外周血中MNPs-Ploy-Apt A549（3 CTCs/m L和6 CTCs/m L）与MNPs-Apt A549（1.5 CTCs/m L和2 CTCs/m L）相比,均捕获到较多的CTCs,表明MNPs-Ploy-Apt A549具有较好的捕获性能。结论通过滚环扩增技术构建了简单、成本低的MNPs-Ploy-Apt A549捕获探针,可高特异性地与肺腺癌细胞结合,实现肺腺癌细胞的高效捕获,捕获效率可达80.06%;MNPs-Ploy-Apt A549优于商业化的MNPs-Ep CAM和MNPs-Apt A549的捕获性能,为肺腺癌细胞捕获和计数奠定了基础,具有潜在的临床应用价值。