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牛结核病(bovine tuberculosis,BT)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis引起的一种慢性消耗性的人畜共患传染病。许多国家采取扑杀结核菌素(PPD)皮试阳性牛的防制策略,取得了良好的效果。但PPD皮试存在费时、费力,判定标准不易掌握及假阳性多的缺点。为有效防止人和动物之间的相互传染,彻底控制和净化牛结核病,需要建立一种检测牛结核病的有效诊断方法。ESAT-6和CFP-10抗原是BT感染早期介导细胞免疫应答的主要优势抗原。同时,ESAT-6和CFP-10蛋白仅存于致病性的分支杆菌中,在BCG菌株和非致病性菌株中均缺失,所以用作特异性诊断抗原,能区别是否为疫苗接种还是其他非致病性分支杆菌感染引起的抗体升高。
本研究以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6、CFP-10两个目的基因片段,将目的基因克隆到pMD18-T Vector,将测序正确的目的基因亚克隆到表达载体pET-32a(+)中,建立了pET-ESAT-6、pET-CFP-10重组表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量30kDa和31kDa左右处分别出现新的蛋白条带,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为5小时时,表达量最高。Western-Blot分析可见,表达的融合蛋白与牛分枝杆菌阳性血清有特异性反应,证明表达产物抗原性良好。将诱导后的菌体进行超声破碎,SDS-PAGE电泳分析表明该融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在,大量表达后,经亲和层析法纯化后获得纯度较高的ESAT-6和CFP-10重组蛋白。
以纯化的重组ESAT-6和CFP-10蛋白作为包被抗原,建立了检测牛结核病抗体的ELISA检测方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件为:抗原包被浓度ESAT-6和CFP-10各2μg/mL,血清稀释倍数为40倍,二抗稀释浓度2000倍,抗原和血清、二抗都是在37℃条件下反应30分钟,底物作用时间为30分钟,阴阳性临界值为0.373。初步建立的检测牛结核病的间接ELISA方法,通过特异性试验、重复性试验验证,表明该方法特异性强、重复性好,对30份PPD皮试阳性的血清和70份PPD皮试阴性的血清用建立的ELISA方法检测,结果EIASA检出阳性24份,共同检出阳性数为18份,共同检出阴性数为68份,EIASA与PPD皮试的阳性符合率为60.0％,阴性符合率为97.1％,两者总符合率为86％。所以该法可以作为PPD皮试诊断的一个补充。