中华绒螯蟹气单胞菌病的病原菌分离、鉴定及其中草药控制研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kdmasong
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中华绒螯蟹是我国最有经济效益的淡水养殖产品之一,但随着中华绒螯蟹养殖规模化、集约化的发展,气单胞菌病给中华绒螯蟹养殖业带来了重重隐患,又因其发病率高及病原菌种类多、增殖快、致病力强,故气单胞菌病在防控上存在一定难度。中草药富含多种有效成分,不仅具有良好的抑菌效果,同时还能增强水产动物的生长性能、血清非特异性与肝胰腺抗氧化能力和抗病原菌感染能力,近些年被广泛用于水产养殖中。本研究对中华绒螯蟹气单胞菌病的病原菌进行了分离鉴定,观察了自然发病中华绒螯蟹肝胰腺和肠道组织病理变化;在此基础上,通过试管二倍稀释法测定了50种中草药对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC),并采用正交t值法将筛选出的抑菌中草药进行了复配,优化了复方中草药制剂的配伍比例,评价了该复方中草药制剂对中华绒螯蟹血清非特异性免疫功能、肝胰腺抗氧化能力及其对中华绒螯蟹抗维氏气单胞菌感染的效果,以期为中华绒螯蟹气单胞菌病的控制提供技术参考。具体研究结果如下:1.从患病中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株具有致病性的病原菌株(HXH1),结合HXH1生理生化特性鉴定、16S r RNA序列及gyr B基因序列分析,确定菌株HXH1为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。菌株HXH1对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为6.92×10~4 CFU·m L-1。组织病理观察显示,与健康中华绒螯蟹相比,患病中华绒螯蟹的肝胰腺细胞排列极其紊乱,局部可见坏死细胞,细胞核固缩深染;局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内。2.以维氏气单胞菌HXH1为抑菌中草药的筛选指示菌株,维氏气单胞菌HXY1和HXY3为筛选对照菌株,采用试管二倍稀释法测定了50种中草药对3株维氏气单胞菌的最小抑菌浓度,其中黄连、苏木、大黄、乌梅、鸡血藤、石榴皮、香薷等7种中草药对维氏气单胞菌抑菌效果较好,MIC为7.81-31.25 mg·m L-1。采用正交t值法将黄连、苏木、大黄、乌梅、鸡血藤、石榴皮、香薷等7种中草药进行了配伍比例优化,确定了黄连、香薷、苏木、石榴皮为复方中草药制剂的最佳组分,其最佳配伍质量比为5:4:1:2。时间-杀菌曲线结果显示复方中草药制剂处理的维氏气单胞菌HXH1浓度较黄连、苏木、香薷、石榴皮等中草药单用时处理的维氏气单胞菌HXH1浓度分别降低了2.01 log CFU·m L-1(p<0.05)、2.18 log CFU·m L-1(p<0.05)、2.77 log CFU·m L-1(p<0.05)、2.92 log CFU·m L-1(p<0.05),表明该复方中草药制剂中各组分具有协同效应。3.以基础饲料为对照,分别在基础饲料中添加5 g/kg、10 g/kg、15 g/kg的复方中草药制剂投喂中华绒螯蟹45 d,发现试验中华绒螯蟹血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活力较不添加复方中草药制剂的对照中华绒螯蟹分别提高了28.0%-40.0%、8.9%-34.8%、24.2%-36.4%、6.3%-37.5%、10.2%-41.4%,而血清中丙二醛(MDA)含量较对照中华绒螯蟹降低了9.9%-23.1%;试验中华绒螯蟹肝胰腺中ACP、AKP、LZM、SOD、CAT的活力较不添加复方中草药制剂的对照中华绒螯蟹分别提高了11.7%-21.3%、3.8%-18.4%、61.6%-137.9%、8.3%-30.2%、2.1%-62.6%,而肝胰腺中MDA含量较对照中华绒螯蟹降低了20.6%-26.5%;而且随着复方中草药制剂使用剂量的增加,中华绒螯蟹血清和肝胰腺中ACP、AKP、LZM、SOD、CAT的活力不断升高,MDA含量不断降低,说明在基础饲料中添加5 g/kg、10 g/kg、15g/kg复方中草药制剂有利于提高中华绒螯蟹血清非特异性免疫功能和肝胰腺抗氧化能力。此外,在基础饲料中添加5 g/kg、10 g/kg、15 g/kg复方中草药制剂对中华绒螯蟹抗维氏气单胞菌感染也具有良好的保护效果,相对保护率分别为40.00%、46.67%、63.33%。根据《渔药临床试验规范》中抗微生物药物有效性评价标准,复方中草药制剂的推荐用量为15 g/kg。
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