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背景介绍幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌,一般定植于胃黏膜上。长期广泛定植在胃黏膜会出现一系列的问题,其中包括胃黏膜细胞的病理变化以及局部微环境的改变,进而导致一系列胃部疾病的发生及演变,比如从慢性浅表性胃炎进展为慢性萎缩性胃炎最后发展为胃癌,研究表明它是引起胃腺癌的高危因素。H.pylori感染范围广,感染人口多,感染率高,因此,明确H.pylori感染的致病机制从而制定针对性的治疗措施具有重要的临床意义。幽门螺杆菌感染引起多种疾病的具体机制至今尚未明确,研究者认为细菌和胃上皮细胞（GECs）之间的相互作用可能是一个关键的决定因素。特别是由细菌毒力因子细胞毒素相关基因A（cag A）蛋白诱导的炎症效应。宿主细胞在cag A进入以后会出现一系列病理反应,进而造成局部微环境改变,细菌定植以及炎症发生发展。大量研究表明cag A在H.pylori感染中发挥着重要的作用。DNA损伤诱导转录因子4（DNA damage-inducible transcript4,DDIT4）,是一种保守并且普遍存在的蛋白质,可在多种刺激下瞬时诱导反应。DDIT4作为哺乳动物雷帕霉素（mammalian target of rapamycin,m TOR）信号通路的内源性抑制剂,可以调节细胞生长、线粒体功能、氧化应激和凋亡。在不同的炎症性疾病中,DDIT4可以发挥不同的作用。然而,在发病率如此高的H.pylori相关胃炎中,DDIT4的表达、调控机制和临床意义却尚不明确。研究DDIT4在H.pylori感染中的表达调控及其调控机制有助于明确DDIT4在H.pylori感染中的具体功能效应,阐明H.pylori持续感染和相关慢性炎症的机制。研究目的1.研究H.pylori感染相关胃炎中胃黏膜以及胃上皮细胞DDIT4表达变化;2.研究H.pylori感染诱导胃上皮细胞DDIT4表达调控机制。研究方法1.H.pylori感染相关胃炎中胃黏膜以及胃上皮细胞DDIT4表达变化研究临床标本标本收集后进行筛选分组,H.pylori感染情况首先通过14C呼吸实验以及快速尿素酶检查初步判定,进一步通过实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）16S r DNA检测以及血清H.pylori抗体检测以明确H.pylori感染。利用RT-PCR、免疫组化及Western blot等方法检测患者胃黏膜DDIT4的表达。根据病理学评价标准将H.pylori感染患者的胃炎标本进行分级,根据炎症程度依次分为轻度,中度和重度胃炎,进而分析评价DDIT4的表达与胃炎程度的相关性。动物实验构建模型:H.pylori感染动物模型构建方法为向小鼠胃部灌H.pylori,之后按照实验规划在指定时间点收集小鼠胃黏膜标本,检测胃黏膜DDIT4表达。H.pylori体外感染取H.pylori感染阴性胃癌患者的正常胃组织,分离其原代胃粘膜用于体外WT H.pylori及Δcag A H.Pylori刺激实验,然后通过RT-PCR和Western Blot方法对DDIT4的表达进行检测。2.H.pylori感染诱导胃上皮细胞DDIT4表达调控机制研究首先使用信号通路阻断剂预处理GECs,然后对细胞进行H.pylori感染,检测DDIT4水平,分析H.pylori感染对胃上皮细胞DDIT4启动子活性影响,最后通过免疫共沉淀实验验证DDIT4启动子的激活水平。研究结果1.H.pylori感染相关胃炎中胃黏膜以及胃上皮细胞DDIT4表达变化研究H.pylori感染患者与未感染者相比,其胃粘膜中DDIT4表达显著增高,表明H.pylori感染促使胃黏膜应激性表达DDIT4,其中cag A+H.pylori感染患者胃粘膜中DDIT4增高更明显。此外,随着炎症程度的加重,DDIT4表达随之增高。表明DDIT4与炎症的发生发展密切相关联。动物模型构建后,每周取小鼠胃粘膜,到第6周的时候,WT H.pylori感染小鼠胃黏膜DDIT4开始增高,第7周时胃黏膜中DDIT4表达达到顶峰。胃上皮细胞系（AGS,BGC-823,GES-1,HGC-27,SGC-7901）在感染H.pylori后DDIT4表达明显增高;AGS细胞、人和小鼠原代胃上皮细胞在感染H.pylori后DDIT4表达明显增高,并且相较于Δcag A H.pylori感染,WT H.pylori感染后DDIT4表达增高更明显。并且随着WT H.pylori感染细菌浓度及感染时间的增加,DDIT4表达随之上调。2.H.pylori感染诱导胃上皮细胞DDIT4表达调控机制研究MAPKp38通路在WT H.pylori感染AGS细胞后明显被激活,p38磷酸化明显上调。而感染Δcag A H.pylori后,p-p38水平无明显变化。质粒转染实验发现cag A能上调p38磷酸化水平,激活MAPKp38通路。进一步研究发现,通过抑制Src来阻断cag A磷酸化后,p38磷酸化水平明显下调,并且DDIT4的表达明显降低。此外,WT H.pylori感染AGS细胞后可以激活DDIT4启动子,而在使用信号通路抑制剂阻断MAPKp38信号通路后,DDIT4启动子活性明显降低。Ch IP实验结果表明,p65可以直接与DDIT4核心启动区域结合,进而介导DDIT4的表达。结论1.H.pylori感染导致胃黏膜及胃上皮细胞中DDIT4表达增高;2.H.Pylori通过磷酸化的cag A蛋白激活MAPKp38通路使p38磷酸化,进而激活NF-κB通路,使DDIT4启动子活性上调,介导胃上皮细胞DDIT4表达增高;意义本研究通过对H.pylori感染相关胃炎的发生机制进行研究,发现了一种H.pylori感染相关胃炎发生发展中的新分子及其表达调控机制。旨在为临床治疗H.pylori感染相关胃炎提供理论指导,为深入探究H.pylori感染引起胃炎的机制以及治疗H.pylori感染相关胃炎提供了新的方向。