目的:1.通过对临床上收集的非综合征型唇腭裂家系血液样本进行DNA提取和全外显子测序获得遗传家系基因测序结果;2.应用生物信息技术对全外显子测序结果进行分析,筛选候选致病基因及位点;3.针对筛选出的候选致病位点及基因,构建携带目标基因和位点变异的基因工程动物模型,探究候选基因和位点的突变对动物模型的表型影响,以及对候选致病基因及位点的致病机制做出初步探索。方法:1.在充分取得患者及其家系成员知情同意的前提下,对家系成员进行流行病学调查,并对参与课题的成员进行全面的体格检查和影像学检查,排除综合征型唇腭裂的存在,收集我国非综合征型唇腭裂家系的血液样本,提取血样中的DNA进行全外显子测序;2.基于人类基因组参考序列hg19,通过GATK、FastQC等软件获取变异位点;通过SIFT、SnpEff、clinvar、DAVID、SeattleSeq等进行变异位点功能注释;以及通过NCBI dbSNP、HapMap、ESP、ExAC等数据库进行筛选。根据突变基因及位点的生物信息特点筛选与非综合征型唇腭裂的相关性较大的候选基因;3.通过应用 UniProt Browser、Mutationassessor、PSIPRED、SWISSMODEL 等软件对候选突变位点进行生物学功能评分,对相关的蛋白质结构进行建模和预测,对比突变前后的结构变化,评估突变可能造成的有害性;4.针对筛选和评估后所得的候选致病基因和位点,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因工程动物模型;本研究通过构建sgRNA载体、Cas9载体,目标动物超数排卵、显微注射、胚胎移植、动物传代、基因型鉴定,获得两个基因品系的纯合子小鼠模型,包括一个基因敲除的模型和点突变的模型;5.通过将纯合子小鼠与同一代出生的野生型小鼠进行对比,表型观察确认肉眼可见的异常发育情况,并拍照记录;应用影像学检查如MRI检查探究纯合子成年小鼠与野生型纯合子小鼠的发育差异;获得纯合子的雌、雄小鼠后,使其交配繁殖获得纯合子小鼠胚胎,应用组织胚胎学实验技术,对获得的胚胎进行组织切片制作及HE染色。结果:1.自2018年9月至2019年10月共收集5个唇腭裂遗传家系,并完成全外显子测序,选取其中遗传学资料相对完善、流行病学情况较为清楚的3个遗传家系进行候选致病基因筛选;2.对3个家系的全外显子测序结果进行位点注释、分析筛选,获得IRF6、CDH1、PTPRF、PTPRD等候选致病基因及位点;3.对候选致病位点进行生物信息学分析,对这些基因对应的蛋白质结构进行预测和建模分析,IRF6、CDH1、PTPRD等基因的突变位点对蛋白结构产生不良影响;4.针对候选致病基因PTPRF、PTPRD构建基因工程动物模型,构建Ptprd点突变的小鼠模型和Ptprf基因敲除的小鼠模型,通过提取DNA、琼脂糖凝胶电泳、一代测序获得了纯合子小鼠模型;5.纯合子小鼠模型颅面部出现的表型包括腭裂及面部发育异常,面部发育异常表型包括双侧眼球发育不对称,面部软组织较对侧萎缩。同时发现泌尿系发育异常;6.纯合子胚胎研究、影像学检查及组织切片发现小鼠胚胎存在不完全致死、单侧眼球缺失、双侧腭裂、单侧腭裂、泌尿系发育异常等情况。结论:1.本研究筛选获得的IRF6、CDH1、PTPRF、PTPRD等候选致病基因及对应位点可能为中国人群非综合征型唇腭裂的风险致病基因;2.本研究发现候选致病基因Ptprf基因缺陷的动物模型颅面部发育异常,包括眼球发育异常、腭裂,并存在不完全致死的情况,该基因可能是我国颅面部出生缺陷的致病基因之一。