乳铁蛋白-EGCG-透明质酸纳米颗粒构建及其递送姜黄素的应用

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随着现代消费者对食品健康和营养的要求越来越高,生物活性物质受到了前所未有的广泛关注。姜黄素是一种具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤等多种生物功能的活性物质,但其稳定性低、水溶性差、易降解、体内生物利用度低等诸多实际问题阻碍了其应用。研究表明,设计合理的食品递送载体是解决该问题的有效方法。蛋白质、多酚、多糖等食品生物大分子不仅具有营养价值,还具有强化食品体系的稳定性和功能性的重要作用。酶具有绿色无毒、高效的催化特性,为食品蛋白质改性提供了新思路。此外,不同极性的功能因子共递送具有协同增效的作用。基于此,本文首先优化了酶促交联乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的制备条件,研究了酶促LF-EGCG共价复合物的制备条件、结构形态和功能属性。进一步地,在酶促LF-EGCG共价复合物的基础上构建LF-EGCG-透明质酸(Hyaluronic acid,HA)三元复合物纳米颗粒,探明了三元复合物纳米颗粒的制备条件、结构特性、稳定性和再分散性。最后,通过模拟体外消化实验和细胞实验证明LF-EGCGHA三元复合物纳米颗粒具有改善姜黄素消化吸收和促进癌细胞凋亡的性质。主要研究内容与结果如下:(1)探究了酶促(漆酶和酪氨酸酶催化氧化)和非酶促(自由基接枝和碱处理)法制备的LF-EGCG共价复合物的最优条件、形成机理和功能性质。研究了EGCG与LF共价结合对LF结构、形态、功能和致敏性的影响。比较了蛋白质、EGCG和酶的加入顺序对酶促共价复合物的影响并优化了酶促反应制备共价复合物的条件。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,酶交联是形成LF-EGCG共价复合物的一种非常有效的方法。圆二色谱等光谱分析表明,与EGCG的结合改变了LF的分子结构。原子力显微镜观察表明,四种共价交联方法影响了LF-EGCG共价复合物的尺寸和形态。与EGCG共价复合后,LF的抗氧化活性和乳化稳定性显著提高。酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验表明,EGCG结合降低了LF对免疫球蛋白E和免疫球蛋白G的结合能力,降低了LF的致敏性。以上结果表明,通过酶促或非酶促法形成的LF-EGCG共价复合物具有潜在的作为食品功能成分的应用前景。(2)探究了食品生物大分子LF-EGCG共价复合物和HA构建的三元复合物纳米颗粒的形成条件及其对姜黄素的包埋和保护效果。在形成LF-EGCG共价复合物(漆酶交联)的基础上,采用pH偏移法制备负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒。研究了最终pH、LF-EGCG与HA的质量比和LF-EGCG与姜黄素质量比对形成颗粒的影响。结果表明,最终pH=6、LF-EGCG与HA的质量比为3:1、LF-EGCG与姜黄素质量比为10:1时得到了粒径为144.7 nm,ζ-电位为-24.76 m V,分布均匀且为单分散分布的球形纳米颗粒。在此条件下,姜黄素的包埋率为85.77%,负载率为5.79%。傅里叶变换红外光谱分析表明,LF-EGCG与姜黄素之间存在疏水相互作用和氢键。X射线衍射结果表明纳米颗粒的包埋改变了姜黄素的晶型结构。负载在纳米颗粒中的姜黄素具有良好的高温、紫外光和贮藏稳定性。此外,纳米颗粒良好的再分散性极大地提高了姜黄素在食品工业中的应用价值。(3)探究了负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒的体外消化特性、细胞毒性、细胞吸收以及抗癌效果。模拟体外消化实验结果表明,与游离姜黄素(生物可及性22.12%)相比,LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒中姜黄素的生物可及性显著提高至53.55%。Caco-2细胞摄取结果表明,姜黄素纳米颗粒的细胞摄取率为82%。细胞活性实验和细胞凋亡实验结果表明,三元复合物纳米颗粒显著促进了HT-29和CT-26的细胞凋亡,且姜黄素和EGCG在促进HT-29细胞凋亡方面可能具有协同效应。综上所述,通过与EGCG酶促交联,LF的功能特性得到显著改善。在酶促交联LFEGCG的基础上,通过pH偏移法成功制备负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒。负载在纳米颗粒中的姜黄素具有良好的光、热、储藏稳定性。LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒具有良好的再分散性。此外,LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒提高了姜黄素的生物可及性和细胞吸收率,同时促进了癌细胞凋亡。该研究为设计具有协同功效的蛋白质基颗粒作为食品和生物医学领域的递送载体提供了理论基础和技术参考。
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