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异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase, IDH)是柠檬酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)的关键限速酶，主要催化异柠檬酸(isocitrate, ICT)氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)，并将NAD(P)+还原成NAD(P)H，释放CO2和ATP。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种革兰氏阴性、非发酵糖及需氧球杆菌，同时也是医院严重感染的重要致病菌。该菌包含2种不同形式的idh基因，分别编码长度为418个氨基酸的AbIDH1(同源二聚体)和长度为745个氨基酸的AbIDH2(单体)。目前，对于鲍曼不动杆菌采用何种机制调控AbIDH1和AbIDH2的活力，从而调节碳通量在TCA循环和乙醛酸旁路(glyoxylate bypass)之间的分配，尚不明确。
Nε-乙酰化和磷酸化是蛋白翻译后修饰(Post-translational modifications, PTMs)的主要形式。前期研究表明，IDH通过Nε-乙酰化或磷酸化调控自身活性的现象普遍存在于细菌中。因此，本课题着重探讨了乙酰化和磷酸化修饰对鲍曼不动杆菌2种IDH活性的影响，为进一步研究IDH活性调控进而调节鲍曼不动杆菌细胞内代谢流的分配机制奠定了基础。
1.鲍曼不动杆菌IDH乙酰化修饰及功能鉴定
蛋白质乙酰化多发生于赖氨酸(Lys, K)位点，通过调研已发表的细菌乙酰化蛋白组学数据，结合氨基酸序列比对，本研究在AbIDH1和AbIDH2中分别确定了9个和2个潜在的乙酰化Lys位点，并通过谷氨酰胺(Gln, Q)替换选定的Lys残基来模拟乙酰化作用，共计成功构建11个模拟乙酰化突变体(K-Q突变体)。其中AbIDH1有9个突变体：AbIDH1-K57Q、AbIDH1-K100Q、AbIDH1-K166Q、AbIDH1-K177Q、AbIDH1-K203Q、AbIDH1-K230Q、AbIDH1-K235Q、AbIDH1-K242Q和AbIDH1-K350Q。这些突变体的比活力分别为野生型AbIDH1(93.3U/mg)的121.4%、0、28.7%、42.7%、41.4%、0%、17.9%、35.3%和61.0%，除了AbIDH1-K57Q活性略有上升，其余突变体活性均有不同程度的下降，甚至AbIDH1-K100Q和AbIDH1-K230Q的活力均丧失，动力学参数的测定结果与比活力基本一致。Lys100是AbIDH1的辅酶结合保守位点，Lys230是AbIDH1的底物结合保守位点，在特殊位点的乙酰化修饰对异柠檬酸脱氢酶的催化活性具有重要影响。2个AbIDH2突变体AbIDH2-K122Q和AbIDH2-K213Q，其比活力分别为野生型AbIDH2(43.3 U/mg)的94.6%和56.0%，动力学参数的测定结果与比活力基本一致，其中AbIDH2-K213Q蛋白活性明显下降，对底物和辅酶的催化效率也均有所下降，表明Lys213可能是AbIDH2潜在的乙酰化调控位点。
为了进一步了解乙酰化对AbIDH1和AbIDH2活性的影响及真实的乙酰化Lys位点，本研究还进行了体外乙酰化实验。利用高能分子乙酰磷酸(acetyl phosphate, AcP)在体外对IDH进行非酶促乙酰化作用，结果表明，当使用500mMAcp处理AbIDH1和AbIDH224h后，2个酶的活力分别下降了43.5%和53.0%。通过质谱分析，在乙酰化的AbIDH1和AbIDH2中，分别鉴定出24个乙酰Lys位点和33个乙酰Lys位点。综合氨基酸序列比对信息和相关的乙酰化蛋白组学研究数据，筛选出12个潜在的AbIDH1Lys位点(其中9个位点与模拟乙酰化位点相同)和2个潜在的AbIDH2Lys位点(与模拟乙酰化的2个位点相同)，进行进一步鉴定。
接下来，本研究通过遗传密码扩展技术，将乙酰赖氨酸(Nε-acetyllysine,AcK)直接引入到选定的位点，共计构建14个真正的乙酰化突变体。其中AbIDH1有12个突变体：AbIDH1-49AcK、AbIDH1-57AcK、AbIDH1-100AcK、AbIDH1-166AcK、AbIDH1-174AcK、AbIDH1-177AcK、AbIDH1-203AcK、AbIDH1-230AcK、AbIDH1-235AcK、AbIDH1-242AcK、AbIDH1-350AcK和AbIDH1-387AcK。这些突变体的比活力分别是野生型AbIDH1(93.3U/mg)的17.3%、42.7%、0、33.9%、3.6%、7.5%、18.0%、0%、7.2%、4.8%、23.0%和7.4%，乙酰化突变体的酶活普遍降低，不同位点之间存在差异。动力学参数的测定结果显示AbIDH1所有乙酰化突变体均不同程度地降低了对辅酶NADP+的亲和力、转换数，对底物ICT的转换数也明显下降。AbIDH2的2个突变体(AbIDH2-122AcK、AbIDH2-213AcK)的比活力占野生型AbIDH2(43.3 U/mg)的相对活力分别是35.1%和41.3%，酶活均明显下降，动力学参数的测定结果显示AbIDH2所有乙酰化突变体均降低对底物和辅酶的转换数，催化效率均下降，但对辅酶NADP+的亲和力有所升高。
2.鲍曼不动杆菌IDH模拟磷酸化研究
蛋白质磷酸化已是公认的至关重要的蛋白质翻译后活性调节方式。本研究通过参考已发表的细菌磷酸化组学数据，结合氨基酸序列比对，选取AbIDH1的Tyr80和AbIDH2的Asp511、His512、Ser523，基于模拟磷酸化状态和改变侧链大小考虑，共计构建13个突变体。4个AbIDH1突变体(AbIDH1-Y80D、AbIDH1-Y80E、AbIDH1-Y80F和AbIDH1-Y80G)的比活力分别是野生型AbIDH1比活力的39.9%、30.1%、48.3%和68.3%。模拟磷酸化状态的2个突变体AbIDH1-Y80D和AbIDH1-Y80E比活力均明显降低，动力学鉴定表明这两个突变体对底物ICT和辅酶NADP+的亲和力及转换数都显著下降，催化效率均降低。最显著的是AbIDH1-Y80E，其对底物和辅酶的催化效率仅为野生型AbIDH1的6.1%和0.2%。AbIDH2Asp511突变体(AbIDH2-D511A)的比活力是16.1U/mg，是野生型AbIDH2的37.1%。对于AbIDH2His512和Ser523分别构建4个突变体：AbIDH2-H512D、AbIDH2-H512E、AbIDH2-H512Y、AbIDH2-H512G和AbIDH2-H512D、AbIDH2-H512E、AbIDH2-H512Y、AbIDH2-H512G，其比活力分别为野生型AbIDH2比活力的80.3%、29.4%、91.0%、101.1%、和33.7%、82.2%、69.4%、103.6%。动力学鉴定结果显示，模拟磷酸化状态的突变体对底物和辅酶的转换数有所下降。因此，AbIDH1的Tyr80以及AbIDH2的Asp511、His512和Ser523磷酸化修饰具有潜在的调控鲍曼不动杆菌IDH活性的功能。
Nε-乙酰化和磷酸化是蛋白翻译后修饰(Post-translational modifications, PTMs)的主要形式。前期研究表明，IDH通过Nε-乙酰化或磷酸化调控自身活性的现象普遍存在于细菌中。因此，本课题着重探讨了乙酰化和磷酸化修饰对鲍曼不动杆菌2种IDH活性的影响，为进一步研究IDH活性调控进而调节鲍曼不动杆菌细胞内代谢流的分配机制奠定了基础。
1.鲍曼不动杆菌IDH乙酰化修饰及功能鉴定
蛋白质乙酰化多发生于赖氨酸(Lys, K)位点，通过调研已发表的细菌乙酰化蛋白组学数据，结合氨基酸序列比对，本研究在AbIDH1和AbIDH2中分别确定了9个和2个潜在的乙酰化Lys位点，并通过谷氨酰胺(Gln, Q)替换选定的Lys残基来模拟乙酰化作用，共计成功构建11个模拟乙酰化突变体(K-Q突变体)。其中AbIDH1有9个突变体：AbIDH1-K57Q、AbIDH1-K100Q、AbIDH1-K166Q、AbIDH1-K177Q、AbIDH1-K203Q、AbIDH1-K230Q、AbIDH1-K235Q、AbIDH1-K242Q和AbIDH1-K350Q。这些突变体的比活力分别为野生型AbIDH1(93.3U/mg)的121.4%、0、28.7%、42.7%、41.4%、0%、17.9%、35.3%和61.0%，除了AbIDH1-K57Q活性略有上升，其余突变体活性均有不同程度的下降，甚至AbIDH1-K100Q和AbIDH1-K230Q的活力均丧失，动力学参数的测定结果与比活力基本一致。Lys100是AbIDH1的辅酶结合保守位点，Lys230是AbIDH1的底物结合保守位点，在特殊位点的乙酰化修饰对异柠檬酸脱氢酶的催化活性具有重要影响。2个AbIDH2突变体AbIDH2-K122Q和AbIDH2-K213Q，其比活力分别为野生型AbIDH2(43.3 U/mg)的94.6%和56.0%，动力学参数的测定结果与比活力基本一致，其中AbIDH2-K213Q蛋白活性明显下降，对底物和辅酶的催化效率也均有所下降，表明Lys213可能是AbIDH2潜在的乙酰化调控位点。
为了进一步了解乙酰化对AbIDH1和AbIDH2活性的影响及真实的乙酰化Lys位点，本研究还进行了体外乙酰化实验。利用高能分子乙酰磷酸(acetyl phosphate, AcP)在体外对IDH进行非酶促乙酰化作用，结果表明，当使用500mMAcp处理AbIDH1和AbIDH224h后，2个酶的活力分别下降了43.5%和53.0%。通过质谱分析，在乙酰化的AbIDH1和AbIDH2中，分别鉴定出24个乙酰Lys位点和33个乙酰Lys位点。综合氨基酸序列比对信息和相关的乙酰化蛋白组学研究数据，筛选出12个潜在的AbIDH1Lys位点(其中9个位点与模拟乙酰化位点相同)和2个潜在的AbIDH2Lys位点(与模拟乙酰化的2个位点相同)，进行进一步鉴定。
接下来，本研究通过遗传密码扩展技术，将乙酰赖氨酸(Nε-acetyllysine,AcK)直接引入到选定的位点，共计构建14个真正的乙酰化突变体。其中AbIDH1有12个突变体：AbIDH1-49AcK、AbIDH1-57AcK、AbIDH1-100AcK、AbIDH1-166AcK、AbIDH1-174AcK、AbIDH1-177AcK、AbIDH1-203AcK、AbIDH1-230AcK、AbIDH1-235AcK、AbIDH1-242AcK、AbIDH1-350AcK和AbIDH1-387AcK。这些突变体的比活力分别是野生型AbIDH1(93.3U/mg)的17.3%、42.7%、0、33.9%、3.6%、7.5%、18.0%、0%、7.2%、4.8%、23.0%和7.4%，乙酰化突变体的酶活普遍降低，不同位点之间存在差异。动力学参数的测定结果显示AbIDH1所有乙酰化突变体均不同程度地降低了对辅酶NADP+的亲和力、转换数，对底物ICT的转换数也明显下降。AbIDH2的2个突变体(AbIDH2-122AcK、AbIDH2-213AcK)的比活力占野生型AbIDH2(43.3 U/mg)的相对活力分别是35.1%和41.3%，酶活均明显下降，动力学参数的测定结果显示AbIDH2所有乙酰化突变体均降低对底物和辅酶的转换数，催化效率均下降，但对辅酶NADP+的亲和力有所升高。
2.鲍曼不动杆菌IDH模拟磷酸化研究
蛋白质磷酸化已是公认的至关重要的蛋白质翻译后活性调节方式。本研究通过参考已发表的细菌磷酸化组学数据，结合氨基酸序列比对，选取AbIDH1的Tyr80和AbIDH2的Asp511、His512、Ser523，基于模拟磷酸化状态和改变侧链大小考虑，共计构建13个突变体。4个AbIDH1突变体(AbIDH1-Y80D、AbIDH1-Y80E、AbIDH1-Y80F和AbIDH1-Y80G)的比活力分别是野生型AbIDH1比活力的39.9%、30.1%、48.3%和68.3%。模拟磷酸化状态的2个突变体AbIDH1-Y80D和AbIDH1-Y80E比活力均明显降低，动力学鉴定表明这两个突变体对底物ICT和辅酶NADP+的亲和力及转换数都显著下降，催化效率均降低。最显著的是AbIDH1-Y80E，其对底物和辅酶的催化效率仅为野生型AbIDH1的6.1%和0.2%。AbIDH2Asp511突变体(AbIDH2-D511A)的比活力是16.1U/mg，是野生型AbIDH2的37.1%。对于AbIDH2His512和Ser523分别构建4个突变体：AbIDH2-H512D、AbIDH2-H512E、AbIDH2-H512Y、AbIDH2-H512G和AbIDH2-H512D、AbIDH2-H512E、AbIDH2-H512Y、AbIDH2-H512G，其比活力分别为野生型AbIDH2比活力的80.3%、29.4%、91.0%、101.1%、和33.7%、82.2%、69.4%、103.6%。动力学鉴定结果显示，模拟磷酸化状态的突变体对底物和辅酶的转换数有所下降。因此，AbIDH1的Tyr80以及AbIDH2的Asp511、His512和Ser523磷酸化修饰具有潜在的调控鲍曼不动杆菌IDH活性的功能。