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目前,半合成头孢菌素类在抗生素市场占据着重要地位,7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产半合成头孢菌素类抗生素的关键中间体,一步酶法可以通过头孢菌素C酰化酶直接酰化头孢菌素C(CPC)获得7-ACA。但CPC酰化酶在应用中仍存在对热敏感、稳定性不佳等问题,提高其热稳定性以进一步推动其工业应用。本论文以酰化酶蛋白晶体结构的B因子的数值作为筛查突变热点的准则,确定可能影响CPC酰化酶热稳定性的关键氨基酸残基,利用蛋白质工程手段改造CPC酰化酶分子,期望得到热稳定性提高的酰化酶突变体。本研究人工合成了三段不同菌株来源的头孢菌素C(CPC)酰化酶,构建应用于大肠杆菌表达系统的重组质粒和菌株,发现其中仅Pseudomonas sp.SE.83 acyII S12 对CPC活性最高。Pseudomonas sp.SE83 acyII S12 基因编码 83kDa 的多肽前体,其前体经自剪切可得到25 kDa α亚基和58 kDa β亚基组成的成熟蛋白。以Pseudomonas sp.SE83 acyＩＩ S12为研究对象主要进行了以下研究:1.从PDB数据库中搜索cephalosporin acylase获得19个晶体数据,结合序列相似性及分析B因子值时对晶体分辨率有一定的要求等指标,最终选择PDB号为4HSR的晶体结构和数据作为本实验中分析SE83 acyＩＩ S12突变位点选择的模板参照。利用discovery studio软件计算得出4HSR蛋白质中氨基酸残基位点B因子数值及其氨基酸的类型并排序,比对4HSR与SE83 acyＩＩ S12多肽链的氨基酸残基α、β序列,在SE83 acyＩＩ S12多肽链中,选择与4HSR中较高B因子值对应的氨基酸残基作为潜在的突变热点。2.针对 Arg218,Lys226,Glu113,Gly547,Trp632,Ser548,Glu454,Glu764,Glu334这9个位点用snap gene软件分别设计了 NNK简并性引物,并构建9个小型的突变文库,基于研究院Biomek高通量平台建立快速筛选程序,从这9个突变文库中进行多次筛选,最终筛选出热稳定性较野生型提高的突变体;也推动了 Biomek自动化工作站的广泛应用。3.对野生型和热稳定性提高的突变体进行蛋白纯化,进而对野生型和突变体蛋白表征催化活性和失活动力学常数,尝试分析蛋白内在结构变化,以揭示氨基酸残基变化对其动力学稳定性的影响因素和分子作用机制,为头孢菌素C酰化酶进一步的改造提供酶学参考。