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克氏原螯虾（Procambarus clarkii）作为我国重要的水产养殖品种,其养殖规模随着人们对水产品需求量的增加而增加,然而经过长时间运输后小龙虾的养殖存活率经常过低,尤其在夏季。在运输过程中,水产动物所受到的外界环境影响因素很多,这些因素可能会使得机体出现程度不一的损伤,胁迫强度的增加会消耗水产动物机体过多能量,导致免疫抑制。个体差异性使得不同个体所能承受的胁迫强度不同,当胁迫强度超过部分体质较弱个体所能调控的阈值时会出现新陈代谢失衡、生理状态紊乱,甚至部分个体死亡。另外,运输后死亡现象也可能与水产动物携带某种或某些条件致病性病原有关。本研究通过检测克氏原螯虾运输前后的免疫应激反应与病原携带、以及运输后养殖的存活率情况等几方面来探究引起克氏原螯虾运输后养殖存活率低的原因,以期能够为改善运输引起的克氏原螯虾死亡现象提供建议与依据,为其运输及养殖生产提供参考;并建立了使用高分辨率溶解曲线（high-resolution melting analysis,HRM）对与白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）抗性性状相关的SNP位点进行基因分型的方法。主要研究内容与结果如下:1.运输胁迫对克氏原螯虾生理状态的影响采用养殖生产中常用的加冰、干露两种运输方式运输约3h。运输后两周内的累积存活率统计结果显示,加冰运输组为63.75%,干露运输组为54.5%,相较而言,加冰运输后存活率较高。养殖的第3-9 d为运输后克氏原螯虾的死亡高峰期。运输胁迫前后克氏原螯虾血清葡萄糖、皮质醇含量及心脏中热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因表达水平变化结果显示,运输胁迫引起克氏原螯虾的应激反应;超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在血清和肝胰腺中的活性变化显示,抗氧化系统响应运输胁迫而激活;运输胁迫后1 d内酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）和溶菌酶（lysozyme,LZM）活性下降,表明运输胁迫抑制了克氏原螯虾的免疫应答。酚氧化酶（prophenoloxidase,pro PO）和C型凝集素（c-type lectin,ctl）基因表达变化结果与免疫相关酶活性变化结果一致。运输胁迫后第5、7 d克氏原螯虾出现大量死亡,对运输胁迫后第5 d和第7 d的濒死虾及正常活力虾的生理状态进行了检测。结果显示,濒死虾血清皮质醇、葡萄糖含量较正常虾活力高,表明濒死虾处于氧化应激状态,而心脏HSP70的表达水平明显低于正常虾。凋亡基因半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）在濒死虾心脏中的表达量显著高于正常活力虾。肝胰腺抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）活性、免疫相关酶（酸性磷酸酶、溶菌酶）活性以及免疫相关基因表达量均显著高于正常活力小龙虾。肝胰腺、肠和鳃的组织学检查结果显示,濒死虾的肝胰腺、肠和鳃均受到不同程度的损伤,其中肝胰腺和肠的损伤较严重。2.运输胁迫与病原对运输前和运输后养殖第5、7 d濒死克氏原螯虾肝胰腺进行了病原携带情况检测,主要包括病毒（十足目虹彩病毒1、白斑综合症病毒及传染性皮下及造血组织坏死病毒等）、真菌（螯虾瘟）、寄生虫（肝肠胞虫）等,同时对运输前克氏原螯虾肝胰腺及运输后濒死虾肝胰腺进行细菌的分离纯化。病毒、真菌、寄生虫检测结果显示克氏原螯虾仅携带WSSV。运输胁迫前后克氏原螯虾肝胰腺WSSV拷贝数检测结果显示WSSV拷贝数在养殖的第3-7 d显著增加,与克氏原螯虾的死亡高峰期为同一时间段,且运输后养殖第5、7 d濒死虾WSSV拷贝数显著高于正常活力虾,表明运输胁迫后克氏原螯虾的死亡与WSSV拷贝数的变化密切相关。从肝胰腺中分离纯化出的优势菌除芽孢杆菌外另分离到一株黄色隆起、边缘不规则的圆形形态菌株,通过菌落形态、生理生化鉴定以及16sr RNA测序分析确认其为微小杆菌Exiguobacterium profundum。通过纸片扩散法测定了该菌株的药物敏感性,结果显示该菌对所测30种药物均敏感。经过回归感染实验判断其可能参与克氏原螯虾的致病过程。3.耐受WSSV选育分子标记检测方法的建立在实验室前期发现的pro PO基因内含子上可能与WSSV抗性相关的三个SNP位点的基础上,进行了连锁不平衡和单倍型分析,发现它们之间具有强连锁不平衡关系。通过分析各SNP位点的单倍型和基因型与WSSV抗性性状的关联性,认为检测SNP＿7081位点基因型是进行WSSV抗性群体选择最方便、最有效的方法。HRM作为一种快速且经济的基因分型方法,本研究中被选择用于SNP＿7081位点的基因分型。通过扩增GC含量为27.94%的68 bp目的片段进行熔解曲线分析,结果所有样品孔均显示为阴性,无法进行自动分组,然而,三种基因型CC、C＞T和T＞C的熔解曲线具有明显差异,可作为标准对样品进行人工基因分型,且准确率为97.61%。通过构建重组质粒p MD18-T-SNP＿7081扩增GC含量为45.24%的目的片段,结果证实GC含量低是造成假阴性的原因。最终,使用加接头引物的方法增加目的片段的GC含量,建立了一种可自动对SNP＿7081位点按照基因型进行分组的改进的HRM基因分型方法,为耐受WSSV克氏原螯虾的选育提供了基础。综上,根据研究结果推测,运输胁迫及运输后养殖环境的变化会引起克氏原螯虾的氧化应激反应,产生活性氧,抗氧化系统被激活以清除活性氧;运输胁迫后养殖前期,免疫反应受到抑制,后期受到WSSV拷贝数增加的影响,免疫相关基因表达水平有所增加;运输胁迫后,由于个体之间的差异,一些克氏原螯虾可以通过自身的调节达到平衡,而一些体质较弱或受胁迫影响较严重的个体超过了自身可以调节的阈值,活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生和消除不平衡,引起DNA、蛋白质和组织损伤,促凋亡基因激活,诱导细胞凋亡,WSSV拷贝数增加,最终导致机体死亡。另外,建立了一种改进与抗WSSV性状相关的SNP位点HRM基因分型的方法,以期能够通过耐受WSSV克氏原螯虾的选育来改善运输引起的克氏原螯虾存活率低的问题。