目的:课题组前期研究发现伤寒沙门菌suf C及t4606基因的表达受两个重要的调节因子Rpo E和Rpo S的双重调控,推测其可能在伤寒沙门菌致病过程中发挥重要作用。suf C在其他肠道致病菌中对铁离子的转运至关重要,参与细菌对抗宿主细胞的氧化应激;伤寒沙门菌t4606基因编码一未知功能的蛋白质,对其基因序列分析发现具有Patatin-like phospholipase的功能基序,本研究旨在对suf C基因及t4606基因在伤寒沙门菌中的功能进行鉴定,揭示两者在伤寒沙门菌致病过程中的作用。方法:一、伤寒沙门菌suf C功能研究(1)suf C基因缺陷变异株的制备:用特异性引物扩增带有suf C基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段,将其电转至含p KD46的伤寒沙门菌野生株,利用λ-Red系统制备suf C的基因缺陷株。(2)suf C基因缺陷回补株的制备:构建重组质粒p ACYC184-suf C,将其及p ACYC184空质粒导入suf C基因缺陷株,制备suf C基因的缺陷回补株及空质粒回补对照株。(3)生长曲线的测定:分别测定S.Typhi野生株、suf C基因缺陷株、suf C基因缺陷回补株和空质粒回补对照株在正常条件、高渗应激、酸和氧应激条件下的生长曲线,比较各菌株的生长差异。(4)suf C基因缺陷株的上皮细胞侵袭实验:将伤寒沙门菌野生株、suf C基因缺陷变异株及其回补株和空质粒回补对照株培养至对数生长期(OD600 0.4),分别感染He La细胞(MOI均为10),分析各菌株对上皮细胞侵袭力的差异。(5)suf C基因缺陷株在巨噬细胞内的生存实验:将伤寒沙门菌野生株、suf C基因缺陷变异株及其回补株和空质粒回补对照株培养至对数生长期(OD600 0.4),分别感染THP-1巨噬细胞(MOI均为10),比较各菌株在巨噬细胞内的生存能力差异,同时在细菌感染巨噬细胞的不同时间点测定上清液中巨噬细胞相关细胞因子的表达水平。二、伤寒沙门菌t4606基因功能研究(1)t4606基因缺陷变异株的制备:构建t4606基因缺损型同源核苷酸片段,采用自杀质粒p GMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌t4606缺陷变异株。(2)t4606基因缺陷回补株的制备:构建重组质粒p BAD-t4606,将其及空质粒p BAD分别导入t4606基因缺陷变异株,制备suf C基因缺陷回补株和空质粒回补对照株。(3)生长曲线测定:测定S.Typhi野生株、t4606基因缺陷株、t4606基因缺陷回补株、空质粒回补对照株在普通条件、高渗应激、酸应激和氧应激条件下的生长曲线,比较各菌株的生长差异。(4)t4606基因缺陷株的上皮细胞侵袭实验,方法同上述伤寒沙门菌t4606基因缺陷株的上皮细胞侵袭实验。(5)t4606基因缺陷株在巨噬细胞内生存实验,方法同上述伤寒沙门菌t4606基因缺陷株的胞内生存实验。结果:(1)经PCR及序列分析验证,成功制备了伤寒沙门菌suf C、t4606基因缺陷株及其回补株和空质粒回补对照株。(2)生长曲线表明,suf C缺陷株在普通条件和高渗应激条件下与野生株的生存能力无明显差异,而在氧应激条件下,suf C缺陷株的生长明显迟缓于野生株,回补suf C基因至suf C缺陷株后,回补株的生长恢复至野生株水平。(3)与野生株相比,suf C缺陷株对上皮细胞的侵袭力明显减弱。(4)与野生株相比,suf C缺陷株在巨噬细胞内的生存能力明显减弱;野生株与suf C缺陷株感染巨噬细胞后,细胞培养上清中均有细胞因子TNF和IL-6的表达,但在suf C缺陷株中TNF和IL-6的表达水平均明显低于野生株。(5)在普通生长条件和氧应激条件下,t4606的缺失对伤寒沙门菌的生长无影响,但在高渗应激条件下,t4606缺陷株的生长明显迟缓于野生株,回补t4606基因至t4606缺陷株后,回补株的生长恢复至野生株水平。(6)与野生株相比,t4606缺陷株在巨噬细胞内的生存能力及其对hela细胞的侵袭力无明显差异。结论:通过两种细菌基因缺失制备系统,我们成功制备了伤寒沙门菌suf C和t4606基因缺陷株及其回补株和空质粒回补对照株。本研究表明,suf C基因有助于伤寒沙门菌在氧应激环境下的生长,促进伤寒沙门菌在巨噬细胞内的存活,且明显增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力,提示suf C基因对于伤寒沙门菌在致病过程中的侵袭和胞内生存两个关键环节具有重要的促进作用。同时,t4606基因促进伤寒沙门菌在高渗应激环境下的生长,而对伤寒沙门菌的侵袭力及在巨噬细胞内的存活能力无明显影响,说明t4606基因可能在伤寒沙门菌感染过程中主要发挥抵抗肠道高渗环境的作用。