【摘 要】
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目的:研究KPNA2在肺腺癌组织中的表达水平及临床意义,观察KPNA2对肺腺癌细胞系恶性生物学行为的影响,初步探讨KPNA2在肺腺癌进展中的分子机制。方法:1.收集94例肺腺癌和30例肺正常组织,免疫组化检测KPNA2的蛋白表达,统计分析KPNA2的表达与临床病理特征及生存预后的关系。2.采用实时荧光定量PCR及Western blot检测BEAS-2B、A549、H1299、H1975及HCC8
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目的:研究KPNA2在肺腺癌组织中的表达水平及临床意义,观察KPNA2对肺腺癌细胞系恶性生物学行为的影响,初步探讨KPNA2在肺腺癌进展中的分子机制。方法:1.收集94例肺腺癌和30例肺正常组织,免疫组化检测KPNA2的蛋白表达,统计分析KPNA2的表达与临床病理特征及生存预后的关系。2.采用实时荧光定量PCR及Western blot检测BEAS-2B、A549、H1299、H1975及HCC827细胞中KPNA2的mRNA及蛋白表达水平,选择KPNA2低表达和高表达的细胞系,进行KPNA2特异性升高或敲减,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测KPNA2基因在肺腺癌细胞中的敲减及过表达的效率。3.通过CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell迁移、Transwell侵袭、流式细胞术、TUNEL实验分别检测敲减或过表达KPNA2基因对肺腺癌细胞系增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力、细胞周期及细胞凋亡的影响;4.通过裸鼠皮下成瘤实验研究敲减KPNA2基因对A549细胞裸鼠成瘤能力的影响;5.采用高通量转录组测序（RNA-Seq）技术检测敲减KPNA2基因后A549细胞转录本变化,通过GO和KEGG分析差异基因的表达变化以及信号通路富集的情况。6.通过Western blot检测敲减或过表达KPNA2基因后肺腺癌细胞中MAPK通路相关蛋白FAK、p-FAK、Raf、p-Raf、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、P38、pP38、JNK、p-JNK表达的变化。结果:1.KPNA2在肺腺癌组织的阳性表达率相对于肺正常组织明显升高,差异有统计学意义（p＜0.05）。KPNA2表达与年龄、肿瘤大小、吸烟状况、性别、分化级别、淋巴结转移状态、T分期、脏层胸膜侵犯、病理分期、支气管切缘、远处转移状态、肿瘤大体类型无相关性（p≥0.05）。生存分析表明KPNA2高表达与肺腺癌患者不良预后无相关性（p≥0.05）。2.检测BEAS-2B、A549、H1299、H1975及HCC827细胞系中KPNA2的m RNA和蛋白表达水平,结果显示,KPNA2在人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞系仅有少量表达,在A549和H1299细胞系表达较高,在HCC827细胞系中表达最低,因此,选择A549和H1299细胞系行KPNA2基因敲减,HCC827细胞系行KPNA2基因过表达进行下一步研究。3.KPNA2敲减,使A549和H1299细胞系增殖能力、克隆形成能力、迁移、侵袭能力受到明显抑制（p＜0.05）;KPNA2过表达,使HCC827细胞系增殖能力、克隆形成能力、迁移、侵袭能力明显增强（p＜0.05）。敲减或过表达KPNA2,肺腺癌细胞系周期分布无显著差异（p≥0.05）,肺腺癌细胞系凋亡率无显著差异（p≥0.05）。但敲减KPNA2后A549、H1299细胞系坏死率显著增加（p＜0.05）。4.裸鼠皮下成瘤实验结果显示敲减KPNA2基因可抑制A549细胞系裸鼠成瘤能力。5.RNA-Seq结果表明,A549细胞系下调KPNA2的表达后,有129个基因下调和61个基因上调表达,通过KEGG富集分析发现差异表达基因在IL-17signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,和MAPK signaling pathway,TNF signaling pathway等通路明显富集。6.Western blot实验结果表明,敲减KPNA2基因,A549细胞系中MEK、pMEK表达明显降低（p＜0.05）;过表达KPNA2基因,HCC827细胞系中MEK、pMEK表达明显升高（p＜0.05）;敲减或过表达KPNA2,肺腺癌细胞中FAK、pFAK、Raf、p-Raf、ERK、p-ERK、P38、p-P38、JNK、p-JNK表达无明显差异（p≥0.05）。结论:KPNA2在肺腺癌组织及细胞系中呈明显高表达,并在体内外促进肺腺癌增殖,促进肺腺癌细胞克隆形成、侵袭、迁移能力,其可能的机制是促进了MEK蛋白活化而发挥功能。
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