帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是第二大常见的神经退行性疾病,其临床特征包括进行性运动迟缓、肌僵硬、静止性震颤和步态障碍等运动症状,以及自主神经和认知功能障碍在内的一系列非运动症状。PD的主要病理特征表现为黑质（Substantia Nigra）区致密带多巴胺能神经元的选择性丢失、α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）异常聚集形成的路易小体和铁沉积。Alpha-syn异常聚集导致黑质区多巴胺能神经元退变是PD的核心致病因素。聚集的α-syn可以使细胞钙稳态失衡从而引起线粒体氧化应激,还有实验表明,α-syn预制原纤维（Pre-formed Fibrils,PFF）可引起细胞内钙离子浓度增加,且PFF进入细胞后沿溶酶体途径运输,但是PFF与溶酶体上钙通道的关系少有报道。瞬时受体电位粘蛋白1（transient receptor potential mucolipin 1,TRPML1）是溶酶体上主要的钙流出通道,当家族性PD患者来源的多巴胺能神经元上调TRPML1时,溶酶体胞吐增加,受阻的α-syn分泌恢复从而减少其在细胞内聚集。TRPML1还是溶酶体膜上的活性氧（reactive oxygen species,ROS）传感器,当TRPML1上调时可以抑制ROS产生,减轻线粒体损伤。然而,TRPML1在α-syn诱发细胞毒性中的保护作用及机制尚未完全阐明。在本课题中,我们选取了两种不同的细胞模型:（1）多西环素（Doxycycline,DOX）诱导的过表达SNCAA53T的细胞模型（inducible PC12 cell model,i PC12细胞模型）,（2）加入α-syn PFF的PC12细胞模型（α-syn PFF细胞模型）,分别检测了过表达α-syn或α-syn PFF,对细胞毒性,细胞内钙离子水平、TRPML1以及线粒体氧化应激的影响;进一步,采用激动剂--ML-SA1激活上述细胞模型中的TRPML1,再检测上述指标。通过上述实验,初步探讨TRPML1在α-syn诱发细胞损伤中的保护作用。具体实验结果如下:1、在本课题中,用DOX处理i PC12细胞不同时间（3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h）后,免疫印迹结果显示,α-syn蛋白水平随DOX处理i PC12细胞时间增加而增加,且在12 h、24 h、48 h的变化有统计学意义（P＜0.05）。细胞毒性检测试剂盒结果显示,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放量随DOX处理i PC12细胞时间增加而增加,且在12 h、24 h、48 h的变化有统计学意义（P＜0.01）。钙比色测定试剂盒结果显示,细胞内钙离子浓度随着DOX处理i PC12细胞时间增加而增加,且在12h、24 h、48 h的变化有统计学意义（P＜0.05）。免疫印迹结果显示,TRPML1蛋白水平随着DOX处理i PC12细胞时间增加而减少,且在48 h的变化有统计学意义（P＜0.05）。因此,我们选用DOX处理i PC12细胞48 h,构建i PC12细胞模型。2、制备α-syn PFF,并构建α-syn PFF细胞模型。透射电子显微镜结果显示,两个浓度组（1 mg/m L,0.1 mg/m L）未超声的α-syn PFF均可观察到明显的纤维体结构;水浴超声1 min后,1 mg/m L的α-syn PFF可观察到较短的纤维,0.1 mg/m L的α-syn PFF超声后基本检测不到纤维,只能观察到非晶态聚合物。我们采用不同浓度（0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml）α-syn PFF处理PC12细胞24 h后,细胞毒性检测试剂盒结果显示,与对照组相比,5μg/mlα-syn PFF处理PC12细胞24 h后LDH释放量显著增加（P＜0.05）。免疫印迹结果显示,与对照组相比,5μg/ml的α-syn PFF处理PC12细胞24 h时TRPML1蛋白水平显著降低（P＜0.05）。因此,我们选用5μg/ml的α-syn PFF处理PC12细胞24h,构建α-syn PFF细胞模型。3、在本课题中,我们采用不同浓度的TRPML1激动剂--ML-SA1（20μM,40μM和60μM）处理PC12细胞24 h。免疫印迹结果显示,与对照组相比,40μM和60μM处理PC12细胞24 h后TRPML1蛋白水平显著升高（P＜0.01）。流式细胞仪结果显示,与对照组相比,不同浓度的ML-SA1处理组ROS水平均无明显变化。由此,我们选用文献中常用的ML-SA1（40μM）作为后续实验条件。4、为探讨TRPML1在α-syn诱发细胞毒性中的作用,本课题在i PC12细胞模型中设计了以下实验分组:对照组,DOX组和DOX+ML-SA1组。细胞毒性检测试剂盒结果显示,与DOX组相比,DOX+ML-SA1组LDH释放量显著降低（P＜0.01）。免疫印迹结果显示,与DOX组相比,DOX+ML-SA1组TRPML1蛋白水平显著增加（P＜0.05）;与DOX组相比,DOX+ML-SA1组α-syn蛋白水平显著降低（P＜0.05）。钙比色测定试剂盒检测结果显示,与DOX组相比,DOX+ML-SA1组细胞内钙离子浓度显著降低（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,DOX组ROS水平显著增加,而与DOX组相比,DOX+ML-SA1组ROS水平显著降低（P＜0.05）;与对照组相比,DOX组线粒体膜电位水平显著降低,而与DOX组相比,DOX+ML-SA1组线粒体膜电位水平显著升高（P＜0.01）。以上结果提示ML-SA1可效减少i PC12细胞内α-syn的聚集和由α-syn表达增多引起的细胞内钙离子增多,ROS水平增加和线粒体膜电位降低。5、本课题中在α-syn PFF细胞模型中设计了以下实验分组:对照组,α-syn PFF组和α-syn PFF+ML-SA1组。细胞毒性检测试剂盒结果显示,与α-syn PFF组相比,α-syn PFF+ML-SA1组LDH释放量显著降低（P＜0.05）。免疫印迹结果显示,与α-syn PFF组相比,α-syn PFF+ML-SA1组TRPML1蛋白水平显著增加（P＜0.05）;与α-syn PFF组相比,α-syn PFF+ML-SA1组α-syn蛋白水平显著降低（P＜0.05）。激光共聚焦显微镜结果显示,对照组细胞在灌流α-syn PFF后,细胞内钙离子浓度随时间显著增加（P＜0.01）;而ML-SA1预处理组细胞在灌流α-syn PFF后,细胞内钙离子浓度无明显变化。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,α-syn PFF组ROS水平显著增加,而与α-syn PFF组相比,α-syn PFF+ML-SA1组ROS水平显著降低（P＜0.05）;与对照组相比,α-syn PFF组线粒体膜电位水平显著降低,而与α-syn PFF组相比,α-syn PFF+ML-SA1组线粒体膜电位水平显著增加（P＜0.05）。JC-1试剂盒结果显示,对照组线粒体膜电位较高,JC-1聚集在线粒体基质中呈现红色荧光,而α-syn PFF组线粒体膜电位降低,JC-1为单体呈现绿色荧光,α-syn PFF+ML-SA1组线粒体膜电位得到改善,JC-1聚集在线粒体基质中呈现红色荧光。以上结果提示,ML-SA1可缓解PC12细胞中α-syn的聚集和由α-syn异常聚集引起的细胞内钙离子增多,ROS水平增加和线粒体膜电位降低。综上所述,在i PC12细胞上,随着DOX处理时间的延长,α-syn表达逐渐增加,TRPML1逐渐表达下降。在DOX处理i PC12细胞48 h时,TRPML1下降最为明显。在PC12细胞上,5μg/ml的α-syn PFF处理24 h时,TRPML1下降的最为明显。这提示,在α-syn过表达或异常聚集发挥毒性作用的时候,TRPML1可能作为保护因子而被显著下调。Alpha-syn过表达或异常聚集均可引起细胞内钙离子增多、ROS产生增多、以及线粒体膜电位下降,而采用TRPML1的激动剂ML-SA1处理后,可增加TRPML1的表达,同时改善α-syn引起的上述变化。这提示,在PD中激活TRPML1,一方面可能通过增加溶酶体胞吐功能而增加胞体分泌α-syn,减少细胞内α-syn的积累,进而减少α-syn诱发的细胞内钙离子增多,并减少ROS产生和线粒体膜电位变化;另外一方面,可能是通过增加线粒体传递信号而促进受损线粒体和ROS的清除,从而减少线粒体膜电位变化,确切的机制值得进一步研究探讨。本课题的开展,不但揭示了TRPML1在α-syn诱发细胞毒性中的保护作用,还为将TRPML1的激动剂--ML-SA1开发为预防或治疗PD的潜在药物提供了实验依据。