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[目的]本课题通过探究人真皮成纤维细胞（Primary Dermal Fibroblast,Normal,Human,Adult,HDFa）中节律基因PER2、BMAL1、CRY1随时间周期性变化,并以PER2基因为代表,探索节律基因与皮肤衰老之间的关系。同时,探究节律基因PER2与褪黑素受体1a（Melatonin Receptor 1a,MT1）细胞信号转导通路及相互作用机制,以期为揭示皮肤抗衰分子机制提供新的理论依据。[方法]1.本研究通过RT-PCR法检测地塞米松同步化作用后HDFa 48 h内（间隔8h）节律基因PER2、BMAL1、CRY1周期性节律情况。2.利用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）干扰节律基因PER2、BMAL1和CRY1,检测基因表达情况。以节律基因PER2为例,检测皮肤衰老相关指标:细胞增殖活力、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平、基质金属酶 1（Matrix metalloproteinasel,MMP1）和 Ⅰ 型胶原（Collagen Type 1,Collagen Ⅰ）的表达,进而探索节律基因与皮肤衰老之间的关系。3.选择MT1受体的内源性配体--褪黑素（Melatonin）作用HDFa后,检测48h内（间隔8 h）PER2节律基因表达情况,同时检测上述皮肤细胞衰老指标:细胞增殖活力、ROS水平、MMP1、collagen Ⅰ的基因及蛋白表达水平变化。4.本研究成功建立了活细胞MT1过表达系统:在293T细胞上过表达MT1受体,褪黑素作用后通过Glosensor检测活细胞cAMP表达同时检测下游蛋白PKA的表达,验证褪黑素和MT1受体结合后能够抑制cAMP/PKA通路。5.使用cAMP/PKA细胞信号转导通路激活剂Forskolin和抑制剂H-89分别作用HDFa后检测PER2、MMP1、collagen Ⅰ的基因及蛋白表达水平,并检测PKA蛋白表达水平。[结果]1.HDFa中节律基因随时间存在周期性变化:地塞米松作用HDFa后节律基因PER2、BMAL1、CRY1的表达能够拟合为正弦波型图。2.节律基因和皮肤衰老的关系:当转染72 h,小干扰RNA敲低实验中siPER2（p＜0.001）、siBMAL1（p＜0.05）、siCRY1（p＜0.01）基因表达水平降低显著,证明该敲低模型成立。敲低PER2时,MMP1（p＜0.01）和collagen Ⅰ（p＜0.01）在mRNA水平上分别增加和降低,MMP1（p＜0.05）和collagen Ⅰ（p＜0.05）在蛋白水平上分别增加和降低;敲低BMAL1,MMP1（p＜0.05）表达下调,collagen Ⅰ表达上调（p＜0.01）;敲低 CRY1,MMP1（p＜0.05）表达下调,collagen Ⅰ（p＜0.05）上调。以PER2基因为例,Western Blot验证敲低PER2后细胞内蛋白水平,PER2（p＜0.01）降低,MMP1（p＜0.05）和 collagen Ⅰ（p＜0.05）分别增加和降低,与mRNA水平趋势一致。3.褪黑素抗衰老作用:褪黑素可促进HDFa增殖（p＜0.01）,并能降低ROS 水平（p＜0.01）。褪黑素作用 HDFa,RT-PCR 检测 mRNA水平,MMP1（p＜0.05）降低,collagen Ⅰ（p＜0.01）增加;ELISA 和 Western Blot 检测培养基上清和细胞内蛋白,结果与mRNA水平保持一致,MMP1（p＜0.05）降低,collagen Ⅰ（p＜0.05）增加。4.活细胞MT1过表达系统的建立:在293T细胞中过表达MT1受体,褪黑素作用后Glosensor检测活细胞cAMP出现降低,Western Blot检测下游蛋白PKA（p＜0.05）降低,成功验证褪黑素结合MT1受体能抑制cAMP/PKA通路。5.节律基因PER2与MT1受体细胞信号转导通路及分子机制:用10 μM Forskolin 作用 HDFa 后能够上调 PER2（p＜0.01）,下调 MMP1（p＜0.05）;10μM H-89 作用 HDFa 后能下调 PER2（p＜0.01）,上调 MMP1（p＜0.01）,下调collagenⅠ（p＜0.01）。50 μM褪黑素作用HDFa后检测48h内节律基因的变化情况,随着时间的增加,波幅下降（约为对照组0.8倍）,并且褪黑素作用并不会影响PER2的节律周期（约为26 h）,也没有引起相位移动,且出现波峰波谷的时间点没有变化。[结论]1.PER2、BAML1、CRY1在HDFa中存在正弦波节律。2.以PER2基因为例,利用siRNA敲低PER2后能够促进MMP1表达并抑制collagen Ⅰ表达,提示PER2基因的低表达可能会促进皮肤衰老,因此推测PER2基因可能是维持皮肤年轻的重要基因;同时,利用siRNA敲低CRY1后,可抑制MMP1表达并促进collagen Ⅰ表达,推测同等条件下CRY1基因的作用可能与PER2基因相反,提示抑制CRY1基因的表达能促进皮肤年轻化,两者之间的相互作用需要进一步验证。3.MT1受体内源性配体--褪黑素在293TMT1受体过表达系统中,能够结合MT1受体,并能招募下游Gi蛋白,抑制下游cAMP/PKA通路。同时,实验证明cAMP/PKA细胞信号转导通路,PER2位于cAMP/PKA通路下游。褪黑素作用HDFa后检测PER2基因表达发现,在周期内可降低PER2节律基因的波幅。由此推测结论:褪黑素通过结合MT1受体,抑制cAMP/PKA通路,进而抑制PER2的表达。4.由上述结论可推测:褪黑素作为人体中普遍存在的内源性激素,可以负调控人体的节律基因PER2。但是,其作用HDFa 24 h/48 h后,表现为能够抑制MMP1表达并促进collagen Ⅰ分泌,发挥一定的抗衰老作用,褪黑素还被发现能够降低ROS的水平,因此褪黑素的抗衰老作用可能是通过其在细胞中发挥强还原剂作用,清除ROS来实现的。