【摘 要】
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目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种高发病率、病死率、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。自噬在HCC中虽具有抑癌和促癌的双重作用,但其机制尚不明确。本研究旨在寻找肝癌自噬相关基因,探究其在HCC发生中的作用及机制,以期为临床诊疗提供新的思路。方法:本研究所使用的RNA-Seq转录组数据及肝癌患者临床数据来源于公共数据库TCGA,ICGC以及UCSC Xena,
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目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种高发病率、病死率、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。自噬在HCC中虽具有抑癌和促癌的双重作用,但其机制尚不明确。本研究旨在寻找肝癌自噬相关基因,探究其在HCC发生中的作用及机制,以期为临床诊疗提供新的思路。方法:本研究所使用的RNA-Seq转录组数据及肝癌患者临床数据来源于公共数据库TCGA,ICGC以及UCSC Xena,自噬相关基因下载自HADb数据库。研究运用秩和检验及Cox单因素回归分析筛选出在肿瘤与正常组织中差异表达的且与肝癌预后相关的自噬基因WDR45B。绘制WDR45B高低表达患者组的Kaplan-Meier生存曲线,利用基因集富集分析寻找潜在通路机制。利用本院2020-2021年58例HCC患者的肝癌组织及3例肝挫伤患者正常肝组织进行免疫组织化学实验,提取人正常肝细胞系LO2,人HCC细胞系Hep G2和Huh-7的RNA及蛋白进行QRT-PCR及蛋白印迹试验,验证WDR45B在肝癌和正常肝中的差异表达。使用慢病毒转导构建WDR45B敲低HCC细胞系,进行CCK8及细胞划痕实验,验证WDR45B缺失对HCC细胞增殖和迁移的影响。检测WDR45B敲低肝癌细胞系中自噬标志蛋白LC3,p62/SQSTM1的表达水平,Akt/m TOR信号通路中Akt及m TOR磷酸化水平以探究WDR45B在HCC发生发展中的具体机制。结果:我们发现自噬基因WDR45B在肝癌组织中表达上调。WDR45B高表达患者,往往预后更差,临床分期更晚。基因组学分析显示WDR45B的甲基化水平对HCC患者的预后有预测作用。基因集富集分析表明WDR45B高表达富集在Akt/m TOR等通路中。基于QRT-PCR,蛋白印记实验和免疫组织化学结果,HCC细胞系WDR45B的表达水平高于正常对照组。敲低WDR45B后,HCC细胞系Hep G2的自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I比值下调,p62/SQSTM1表达水平上调,表明自噬活性被抑制。Akt/m TOR通路中Akt和m TOR表达水平无明显差异,但二者的磷酸化水平显著升高,使用自噬诱导剂雷帕霉素发现可以部分逆转WDR45B敲低后的自噬抑制状态,验证了WDR45B敲低后的自噬抑制。最后,CCK8实验及细胞划痕实验结果显示WDR45B敲低后HCC的增殖和迁移能力被抑制。结论:自噬相关基因WDR45B在肝癌中差异性高表达,与不良预后及更差的分期有关;降低WDR45B表达可以促进Akt/m TOR通路抑制自噬,减弱癌细胞的增殖和迁移能力。WDR45B有望成为新的肝癌预后生物标志物及分子治疗的潜在靶点。
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