【摘 要】
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目的:在肠上皮屏障损伤模型中观察miR-192-5p与自噬的关系,确定miR-192-5p作用下结肠细胞自噬状态和屏障功能的改变,探究miR-192-5p对肠上皮屏障功能的影响和作用机制。方法:通过在线数据库分析miR-192-5p及Rictor在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）中的表达变化。使用肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor
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目的:在肠上皮屏障损伤模型中观察miR-192-5p与自噬的关系,确定miR-192-5p作用下结肠细胞自噬状态和屏障功能的改变,探究miR-192-5p对肠上皮屏障功能的影响和作用机制。方法:通过在线数据库分析miR-192-5p及Rictor在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）中的表达变化。使用肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）刺激Caco2细胞和NCM460细胞,以此模拟IBD的炎症损伤。分别利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）、蛋白印迹技术（Western blot,WB）检测miR-192-5p和Rictor的表达变化。通过向细胞瞬时转染mimics模拟物构建结肠细胞miR-192-5p过表达模型,检测Rictor蛋白含量的变化观察miR-192-5p对Rictor的靶向作用,检测p62和LC3B的蛋白水平评估细胞内自噬的改变。利用Ad-m Cherry-GFP-LC3B双标腺病毒感染结肠细胞,通过荧光显微镜观察自噬体的形成。用Transwell板构建Caco2细胞单层模型,测量其跨上皮电阻（Transepithelial electrical resistance,TEER）和异硫氰酸荧光素葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate-Dextran,FITC-dextran）渗透率以反映肠屏障的紧密性和完整性。使用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）激动剂3BDO处理结肠细胞,观察3BDO对自噬及miR-192-5p的作用。结果:分析在线数据库数据可知,miR-192-5p在IBD组织中表达下降,而Rictor表达升高。同样地,TNF-α的刺激可使miR-192-5p下调而Rictor上调。在结肠细胞中过表达miR-192-5p,Rictor的表达受到抑制,且p62蛋白水平下调且LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化增多,在荧光显微镜下可见自噬小体形成增加,提示miR-192-5p的自噬水平上调。TNF-α刺激后,结肠细胞的自噬相关蛋白水平改变,同时屏障蛋白ZO-3下调、claudin-2上调,Caco2细胞单层模型也显示肠上皮电阻值下降而FITC-dextran渗透率增加,提示肠屏障功能受损,而过表达miR-192-5p可缓解上述指标的变化。3BDO处理后细胞的自噬受到抑制,而miR-192-5p在IBD肠上皮损伤模型中起到的作用可被3BDO逆转。结论:在TNF-α模拟的肠上皮屏障损伤模型中,miR-192-5p至少部分通过靶向Rictor-m TOR信号通路调节细胞的自噬以缓解TNF-α对肠上皮屏障的刺激。
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