目的:人类骨骼虽然具有一定的自愈能力,但是这种能力无法应对临床上的多种广泛损伤。因此,骨缺损的修复依然是骨科临床上面临的最大难题之一。骨移植是目前临床上针对骨缺损问题最主要的治疗方式之一。但目前用于骨移植治疗的植入物受到极大的限制,自体骨来源有限,异体骨存在免疫排斥、传播传染性疾病等风险。因此,本文旨在通过添加羧甲基壳聚糖和海藻酸钠,研发一种具有生物活性的复合羧甲基壳聚糖/海藻酸钠磷酸镁骨水泥（MPC-CMCS/SA）。通过综合评价该材料的抗压强度、可注射性、凝固时间、抗溃散性和体外降解率等物化性质,判断该材料是否能够作为骨缺损早期填充物,起到一定的机械支撑作用。通过对物化性质的评价,选取性能相对最为优异的材料组。通过体内外实验,评价该材料的生物相容性,探索羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的最佳添加量,分析该材料对骨缺损修复的促进作用及其机制。方法:1.MPC-CMCS/SA体系由固液两相组成。本文将重烧氧化镁及磷酸二氢钾以1.5:1的摩尔比均匀混合作为固相。将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠分别按照占固相质量分数的1%、2%、3%和4%均匀混合,加入去离子水中,配成溶液。将固相和液相按照固液比2:1的比例均匀混合,转移至定制模具中,待复合材料自固化24h后脱模,取1000目砂纸打磨材料,打磨平整后于37℃,100%湿度条件下放置48h。2.检测MPC-CMCS/SA的物化性能。使用万能材料实验机测量其抗压强度;使用p H剂测量其p H值;使用维卡仪测量其凝固时间;使用X射线衍射仪测量其化学成分;使用傅里叶红外光谱仪测量其化学键变化;使用场发扫描电镜测量其表面形貌;使用热电偶测量其放热温度;使用电感耦合等离子体原子发射光谱法测量其浸提液中镁离子的释放浓度。对各组MPC-CMCS/SA的物化性能进行评价,选择性能相对最为优异的组,继续后续体内外实验。3.检测MPC-CMCS/SA的生物学性能。采用细胞增殖实验评价成骨细胞的生长情况;采用场发扫描电镜和激光共聚焦显微镜分别评价了成骨细胞在MPC-CMCS/SA表面的黏附情况;采用q PCR和Western blotting分别评价了MPC-CMCS/SA的促成骨分化表达的效应;构建大鼠颅骨缺损模型,采用Micro-CT和组织学染色分析,评价MPC-CMCS/SA在实验动物体内促进骨缺损修复的效应。在此基础上,并对MPC-CMCS/SA促进成骨分化的作用机制进行探索。结果:1.可注射性结果表明,随着CMCS和SA的增加,MPC-CMCS/SA复合材料的注射时间延长,MPC-CMCS/SA（4%）的注射时间可达2.9分钟。凝固时间结果表明,MPC-CMCS/SA的凝固时间随着CMCS和SA的增加而显著增加,MPC-CMCS/SA（4%）的凝固时间可达到12.8分钟。放热温度结果表明,随着CMCS和SA的加入,水化反应的最高温度显著降低,MPC-CMCS/SA（4%）的最高温度降至39.4℃。抗压强度结果表明,初始凝固后继续水化,抗压强度在72小时左右稳定。随着CMCS和SA的增加,抗压强度先增大后减小。MPC-CMCS/SA（2%）的抗压强度最高,约为MPC的1.4倍。体外降解率结果表明,CMCS和SA的加入延缓了MPC-CMCS/SA的体外降解,MPC-CMCS/SA（2%）的降解最慢。抗溃散性结果表明,随着CMCS和SA的增加,MPC-CMCS/SA的抗溃散性先增大后减小,其中MPC-CMCS/SA（2%）的抗溃散性最佳。XRD分析结果表明,在MPC组和MPC-CMCS/SA组中均可观察到KMg PO4·6H2O和未反应Mg O的特征峰。傅里叶红外光谱仪分析结果表明,与MPC、MPC-CMCS和MPC-SA相比,MPC-CMCS/SA的特征峰出现偏移,振动频率下降,峰值向更长的波长方向偏移。扫描电镜（SEM）结果显示,MPC主要由KMg PO4·6H2O晶体组成,表面脆性高,裂纹多。随着CMCS和SA的增加,MPC-CMCS/SA的表面裂纹先减小后增大。MPC-CMCS/SA（2%）的SEM图像显示,加入CMCS和SA后,KMg PO4·6H2O晶体之间的裂纹被填满,表面更加光滑。2.由于MPC-CMCS/SA（2%）表现出相对最好的物化性能,因此选择其作为进一步的实验,以MPC组为对照。荧光成像和扫描电镜检测细胞形态和黏附情况,结果显示MC3T3-E1细胞粘附并扩散在两组样品上,MPC-CMCS/SA（2%）组细胞形成更多伪足,扩散范围更广。此外,荧光图像显示,MPC-CMCS/SA（2%）组上的细胞数量高于MPC组,且细胞在MPC-CMCS/SA（2%）组上代表细胞黏附的指标Actin高于MPC组。ALP活性是成骨分化过程中成骨细胞活性的重要指标。ALP结果表明,从第7天到第14天,所有样本MC3T3-E1细胞ALP活性均迅速升高。第14天,ALP活性几乎随CMCS/SA的增加呈线性增加。q PCR结果表明,相对于7天和14天在MPC组上生长的细胞,在MPC-CMCS/SA组上培养的细胞中,成骨相关基因表达水平也有所增加。Western blotting结果表明,MPC-CMCS/SA对成骨相关蛋白表达的影响与基因表达数据一致。动物实验中,骨缺损的Micro-CT三维重建结果表明,愈合1个月后,MPC-CMCS/SA组植入样品中心区域和边缘形成新骨,而MPC组几乎没有新骨形成,主要在边缘处。植入三个月后,MPC-CMCS/SA样品降解速度比MPC快,新骨形成更厚、更连续。此外,新生骨结构参数结果表明,1个月时,MPC-CMCS/SA组的骨体积分数BV/TV略高于MPC组。3个月时,MPC-CMCS/SA（2%）组BV/TV显著升高。Tb.N和Tb.Th与BV/TV结果一致,骨小梁分离度Tb.Sp与之相反。组织学结果包括HE、von Kossa和Masson染色。HE染色结果显示,一个月后,两组均出现轻度至中度炎症反应,样本周围有少量巨噬细胞和异物巨细胞。此外,在两组样本的边缘观察到最小的骨形成,而MPC-CMCS/SA组的样本骨形成高于MPC组。von Kossa和Masson染色与HE染色一致。植入术3个月后,MPC-CMCS/SA组相对于MPC组水泥残留较少。与1个月的切片相比,两组显示出更多的骨形成。骨形成主要发生在MPC-CMCS/SA组,骨长入主要发生在MPC组样品的硬脑膜侧,种植体中心纤维组织较多。探索机制时发现,黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）在黏附依赖信号传导和成骨中起重要作用。MPC-CMCS/SA-1和MPC-CMCS/SA（2%）在MC3T3-E1细胞24 h时促进FAK磷酸化,抑制FAK下游效应物β-catenin的磷酸化。当FAK抑制剂加入MPC-CMCS/SA（2%）组,FAK磷酸化被抑制,β-catenin磷酸化增强。结论:本文通过添加羧甲基壳聚糖和海藻酸钠,成功构建了一种具有良好物化性能和生物活性的复合磷酸镁骨水泥（MPC-CMCS/SA）。实验结果表明,羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的添加提升了MPC的抗压强度、延缓了体外降解速率、延长了凝固时间、降低了放热温度等。体外细胞实验和体内实验结果表明,羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的添加改善了MPC的生物相容性,增加了细胞在材料上的黏附增殖,并促进成骨分化、新骨生成,有利于骨缺损的修复。在此基础上,本文发现MPC-CMCS/SA通过Integrin-FAK-Wnt信号传导通路对成骨分化过程进行调控。本文认为MPC-CMCS/SA是一种具备良好临床应用前景的生物活性骨修复材料。