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第一章雌激素调控LncRNAH19/miR-216a/ACTA2轴促进子宫内膜异位症基质细胞的侵袭和迁移
研究背景:子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)指子宫内膜组织(基质和腺体)出现在除子宫体以外的部位，简称为内异症。它是一种雌激素依赖性疾病，临床表现多为慢性盆腔疼痛、性交疼痛、月经不调、不孕等，在育龄期女性中发病率约为10％，在不孕症女性中发病率高达50％，是严重影响女性身心健康的常见妇科内分泌疾病，并且目前尚无有效的手段能够完全根治内异症。虽然内异症在形态学上呈现良性表现并不影响患者寿命，但从临床行为学角度上来看子宫内膜组织具有与恶性肿瘤类似的特点，例如内膜组织能够异位种植、生长、侵袭和迁移等，因此该疾病也被称为“良性癌”，所以现代科学对内异症发病机制的研究具有重要意义。“在位内膜决定论”指出子宫内膜的自身生物学特性是内异症发生的决定性因素，并且局部微环境的改变是影响内异症发生发展的重要因素。内异症的临床诊断“金标准”是腹腔镜手术下发现异位病灶，根据该疾病的病理生理特点发现，异位病灶处多有纤维结缔组织包裹，这是因为内膜细胞侵袭和迁移到异位处发生周期性损伤修复，基质组织具有侵袭和迁移的能力并发生内膜基质纤维化向成纤维化转变，从而发生细胞粘附、胶原聚集最终形成纤维化，体内长期高水平雌激素刺激会导致内膜基质细胞发生基质纤维化向成纤维化的转变的加重，同时加速内膜细胞的侵袭和迁移能力，从而引起该疾病一系列临床症状如慢性炎症、进行性盆腔疼痛和不孕等。LncRNAH19是第一个发现的长链非编码RNA，H19在肿瘤发生过程中能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制肿瘤细胞凋亡的作用，但该非编码RNA在内异症中的研究尚不足。由于异位病灶纤维化包裹是该疾病发生发展和病理分级的重要标志，ACTA2作为纤维组织平滑肌细胞的重要标志物也是鉴定组织纤维化的指标蛋白，在内异症在位内膜中的研究尚无报道，我们拟通过探讨H19、ACTA2在参与子宫内膜异位症中的作用和异位病灶纤维化包裹现象发病机制的研究，用以寻找新的诊断靶点和治疗手段。
研究目的:明确H19在内异症中的表达变化，深入研究在位内膜中H19差异表达对下游基因的潜在功能影响和分子机制发挥的作用，尤其是解释异位病灶处的纤维结缔组织包裹现象。探讨雌激素、H19、ACTA2之间的关系以及对在位内膜功能的影响，从表观遗传学角度探讨子宫内膜异位症的发病机制，为临床诊断和治疗提供研究基础。
研究方法:本章节研究中，共纳入23例内异症在位内膜作为实验组，同时纳入配对23例女性子宫内膜作为对照组，分别获取每组每人的子宫内膜原代基质细胞(euESC)进行研究。在表达量测定方面，通过qRT-PCR和WB实验验证H19和ACTA2在euESC的表达水平，利用Pearson检验分析两者间的相关性;在细胞功能研究方面，使用EdU和CCK8实验研究H19和ACTA2对内异症euESC增殖水平的影响，通过Transwell实验研究H19和ACTA2对内异症euESC的侵袭和迁移水平的影响;在验证分子机制方面，首先通过生物信息学方法分析H19、ACTA2之间是否有通过miRNA参与调控的内源性竞争性RNA(ceRNA)相互作用分子机制，并经Luciferase实验验证该分子机制，为了进一步探讨ceRNA在内异症euESC的作用，通过RNA挽救实验验证miRNA在H19和ACTA2之间存在调控作用，并探讨是否影响内异症euESC细胞的功能;由于子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，最后我们通过对内异症euESC的雌激素加药处理，研究雌激素是否可以通过调控ceRNA分子机制对内异症euESC功能产生影响。
结果:qRT-PCR和WB结果显示H19和ACTA2在内异症euESC中显著性高表达，且两者具有正相关性，但在对照组中两者没有明显的相关性;分别敲降H19和ACTA2后，内异症euESC的侵袭和迁移功能表现出明显的下降，但在细胞增殖水平的影响方面，敲降H19可明显抑制内异症euESC的增殖水平，而敲降ACTA2并不能显著性改变内异症euESC的增殖水平;通过生物信息学分析得出miR-216a-5p和H19、ACTA2具有靶向结合位点，结合Luciferase实验也验证了miR-216a-5p能够通过特异性靶向位点分别结合于H19的外显子区和ACTA2的3UTR非编码区，根据RNA挽救实验，我们也发现miR-216a-5p能够通过竞争性结合的作用抑制下游ACTA2的基因表达，也能抑制上游H19的表达，从而进一步调控内异症euESC的侵袭和迁移水平;针对雌激素的研究，通过短效时间的雌激素加药处理内异症euESC，我们发现雌激素可通过调控H19/miR-216a-5p/ACTA2信号通路促进内异症euESC的侵袭和迁移水平，但对细胞的增殖水平作用不大。
结论:H19和ACTA2在内异症euESC中显著性高表达，且两者具有正相关性，而低表达的H19和ACTA2能够抑制内异症euESC的侵袭和迁移水平，两者间受到miR-216a-5p的特异性靶向结合位点的负向调控作用，并且影响内异症euESC的侵袭和迁移水平，雌激素也可通过调控H19/miR-216a-5p/ACTA2信号通路促进内异症euESC细胞的侵袭和迁移水平。
第二章STING/IRF3/IFNb1信号通路在子宫内膜异位症中的作用和发病机制的研究
研究背景:子宫内膜异位症是一种严重影响女性身心健康的常见妇科内分泌疾病目前尚无有效的手段能够完全治疗内异症。内异症的病因复杂，因此病因学和发病机制的研究对内异症的早期预警、诊断和治疗干预具有重要意义。值得注意的是，“在位内膜决定论”学说除了认为子宫内膜生物学特性是内异症发生的决定性因素外，局部微环境的改变也是内异症发生的重要影响因素，因此除了在上一章节针对内膜本身特性的研究以外，许多学者也发现患者自身内环境的改变是导致在位内膜能够在除宫腔以外部位种植、生长、侵袭和迁移的重要原因。而越来越多的研究也证实内异症是一个慢性炎症性疾病，免疫调节异常在内异症的发生发展各个环节中起重要作用，其发病机制与机体免疫功能失衡息息相关。一般认为在位内膜经过粘附、增殖、侵袭和迁移，免疫逃逸，新生血管形成，诱发慢性炎症从而形成异位病灶，这是由于子宫内膜异位症的免疫功能失调和异位病灶免疫微环境失调两方面因素共同发挥作用，一方面表现为免疫监视功能的降低、免疫杀伤性细胞的细胞毒作用的减弱而无法有效清除异位内膜，免疫逃逸功能增强以致异位内膜生长。在临床工作中，我们通过腹腔镜手术发现异位病灶处通常伴随着炎症充血，内异症患者表现出具有自身免疫性疾病的特征，其中患者腹腔液中的巨噬细胞、细胞炎性因子、生长因子和血管生成物质等增加，从而促进异位内膜组织的存活、增殖并导致局部纤维结缔组织增生和粘连。前期工作中，我们通过高通量蛋白质组学技术，发现STING(stimulator of interferon genes)基因在子宫内膜异位症在位内膜和正常的内膜组织中存在差异表达。STING即为干扰素刺激因子蛋白，是一种胞内DNA受体蛋白，能识别细胞质中外源性或内源性的双链DNA磷酸化下游TBK1、IRF3等蛋白信号通路，进入细胞核后刺激细胞核释放干扰素b1释放到细胞质内，是一种天然免疫相关蛋白。
研究目的:初步研究STING基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用，深入探究该蛋白在内异症中发挥的功能和潜在的分子机制，为内异症临床诊疗提供新的研究基础。
研究方法:本章节研究共纳入15例内异症在位内膜作为实验组，同时纳入配对15例女性子宫内膜作为对照组，其中4对内膜进行iTRAQ法的高通量蛋白质组学检测差异表达的蛋白质，经过前期研究后，初步筛选得出STING蛋白的差异表达后，用余11对标本进行WB实验和IHC实验验证，在功能实验中，使用子宫内膜基质细胞系(HESC)检测STING蛋白对HESC的增殖、侵袭和迁移水平的影响，另外进一步研究STING蛋白信号通路在基质细胞中所发挥的作用以及对细胞功能的影响。
结果:针对内异症在位内膜蛋白质组学初步筛选后，发现免疫相关分子蛋白是重要组成部分，而其中天然免疫相关的STING蛋白具有显著性差异。随后验证该蛋白表达，根据WB结果发现，STING蛋白在内异症在位内膜组织显著低表达，而对IHC结果分析发现，STING蛋白在正常内膜组织中的基质和腺上皮均有表达，而在内异症中，主要在在位内膜基质部有表达，但在异位内膜组织中，STING主要在腺上皮中表达。进一步研究STING对内膜基质细胞功能的影响后发现，低表达的STING蛋白能够促进基质细胞增殖、侵袭和迁移的能力，与STING密切相关的STING/IRF3/IFNb1信号通路在HESC细胞中，随着STING蛋白的低表达，该信号通路的作用也降低，主要表现为磷酸化的IRF3和TBK1表达降低，IFNb1的分泌水平降低。为了进一步研究STING/IRF3/IFNb1信号通路分泌到胞外的IFNb1对基质细胞功能的影响，我们对低表达STING的基质细胞中外源性加入IFNb1，发现IFNb1能够逆转性降低基质细胞的侵袭和迁移功能，但对细胞增殖水平逆转影响有限。
结论:在本章节中，研究内异症在位内膜发现了具有明确低表达和促进细胞侵袭和迁移功能的STING蛋白，并发现STING蛋白在内异症的表达分布有明显差异，主要是在位内膜的基质和异位内膜的腺上皮表达，同时阐明STING可通过STING/IRF3/IFNb1信号通路在基质细胞中发挥影响细胞侵袭和迁移能力的作用。进一步丰富了天然免疫相关的内异症病因学研究，为进一步拓展内异症的发病机制研究和指导临床治疗工作带来了新思路。
研究背景:子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)指子宫内膜组织(基质和腺体)出现在除子宫体以外的部位，简称为内异症。它是一种雌激素依赖性疾病，临床表现多为慢性盆腔疼痛、性交疼痛、月经不调、不孕等，在育龄期女性中发病率约为10％，在不孕症女性中发病率高达50％，是严重影响女性身心健康的常见妇科内分泌疾病，并且目前尚无有效的手段能够完全根治内异症。虽然内异症在形态学上呈现良性表现并不影响患者寿命，但从临床行为学角度上来看子宫内膜组织具有与恶性肿瘤类似的特点，例如内膜组织能够异位种植、生长、侵袭和迁移等，因此该疾病也被称为“良性癌”，所以现代科学对内异症发病机制的研究具有重要意义。“在位内膜决定论”指出子宫内膜的自身生物学特性是内异症发生的决定性因素，并且局部微环境的改变是影响内异症发生发展的重要因素。内异症的临床诊断“金标准”是腹腔镜手术下发现异位病灶，根据该疾病的病理生理特点发现，异位病灶处多有纤维结缔组织包裹，这是因为内膜细胞侵袭和迁移到异位处发生周期性损伤修复，基质组织具有侵袭和迁移的能力并发生内膜基质纤维化向成纤维化转变，从而发生细胞粘附、胶原聚集最终形成纤维化，体内长期高水平雌激素刺激会导致内膜基质细胞发生基质纤维化向成纤维化的转变的加重，同时加速内膜细胞的侵袭和迁移能力，从而引起该疾病一系列临床症状如慢性炎症、进行性盆腔疼痛和不孕等。LncRNAH19是第一个发现的长链非编码RNA，H19在肿瘤发生过程中能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制肿瘤细胞凋亡的作用，但该非编码RNA在内异症中的研究尚不足。由于异位病灶纤维化包裹是该疾病发生发展和病理分级的重要标志，ACTA2作为纤维组织平滑肌细胞的重要标志物也是鉴定组织纤维化的指标蛋白，在内异症在位内膜中的研究尚无报道，我们拟通过探讨H19、ACTA2在参与子宫内膜异位症中的作用和异位病灶纤维化包裹现象发病机制的研究，用以寻找新的诊断靶点和治疗手段。
研究目的:明确H19在内异症中的表达变化，深入研究在位内膜中H19差异表达对下游基因的潜在功能影响和分子机制发挥的作用，尤其是解释异位病灶处的纤维结缔组织包裹现象。探讨雌激素、H19、ACTA2之间的关系以及对在位内膜功能的影响，从表观遗传学角度探讨子宫内膜异位症的发病机制，为临床诊断和治疗提供研究基础。
研究方法:本章节研究中，共纳入23例内异症在位内膜作为实验组，同时纳入配对23例女性子宫内膜作为对照组，分别获取每组每人的子宫内膜原代基质细胞(euESC)进行研究。在表达量测定方面，通过qRT-PCR和WB实验验证H19和ACTA2在euESC的表达水平，利用Pearson检验分析两者间的相关性;在细胞功能研究方面，使用EdU和CCK8实验研究H19和ACTA2对内异症euESC增殖水平的影响，通过Transwell实验研究H19和ACTA2对内异症euESC的侵袭和迁移水平的影响;在验证分子机制方面，首先通过生物信息学方法分析H19、ACTA2之间是否有通过miRNA参与调控的内源性竞争性RNA(ceRNA)相互作用分子机制，并经Luciferase实验验证该分子机制，为了进一步探讨ceRNA在内异症euESC的作用，通过RNA挽救实验验证miRNA在H19和ACTA2之间存在调控作用，并探讨是否影响内异症euESC细胞的功能;由于子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，最后我们通过对内异症euESC的雌激素加药处理，研究雌激素是否可以通过调控ceRNA分子机制对内异症euESC功能产生影响。
结果:qRT-PCR和WB结果显示H19和ACTA2在内异症euESC中显著性高表达，且两者具有正相关性，但在对照组中两者没有明显的相关性;分别敲降H19和ACTA2后，内异症euESC的侵袭和迁移功能表现出明显的下降，但在细胞增殖水平的影响方面，敲降H19可明显抑制内异症euESC的增殖水平，而敲降ACTA2并不能显著性改变内异症euESC的增殖水平;通过生物信息学分析得出miR-216a-5p和H19、ACTA2具有靶向结合位点，结合Luciferase实验也验证了miR-216a-5p能够通过特异性靶向位点分别结合于H19的外显子区和ACTA2的3UTR非编码区，根据RNA挽救实验，我们也发现miR-216a-5p能够通过竞争性结合的作用抑制下游ACTA2的基因表达，也能抑制上游H19的表达，从而进一步调控内异症euESC的侵袭和迁移水平;针对雌激素的研究，通过短效时间的雌激素加药处理内异症euESC，我们发现雌激素可通过调控H19/miR-216a-5p/ACTA2信号通路促进内异症euESC的侵袭和迁移水平，但对细胞的增殖水平作用不大。
结论:H19和ACTA2在内异症euESC中显著性高表达，且两者具有正相关性，而低表达的H19和ACTA2能够抑制内异症euESC的侵袭和迁移水平，两者间受到miR-216a-5p的特异性靶向结合位点的负向调控作用，并且影响内异症euESC的侵袭和迁移水平，雌激素也可通过调控H19/miR-216a-5p/ACTA2信号通路促进内异症euESC细胞的侵袭和迁移水平。
第二章STING/IRF3/IFNb1信号通路在子宫内膜异位症中的作用和发病机制的研究
研究背景:子宫内膜异位症是一种严重影响女性身心健康的常见妇科内分泌疾病目前尚无有效的手段能够完全治疗内异症。内异症的病因复杂，因此病因学和发病机制的研究对内异症的早期预警、诊断和治疗干预具有重要意义。值得注意的是，“在位内膜决定论”学说除了认为子宫内膜生物学特性是内异症发生的决定性因素外，局部微环境的改变也是内异症发生的重要影响因素，因此除了在上一章节针对内膜本身特性的研究以外，许多学者也发现患者自身内环境的改变是导致在位内膜能够在除宫腔以外部位种植、生长、侵袭和迁移的重要原因。而越来越多的研究也证实内异症是一个慢性炎症性疾病，免疫调节异常在内异症的发生发展各个环节中起重要作用，其发病机制与机体免疫功能失衡息息相关。一般认为在位内膜经过粘附、增殖、侵袭和迁移，免疫逃逸，新生血管形成，诱发慢性炎症从而形成异位病灶，这是由于子宫内膜异位症的免疫功能失调和异位病灶免疫微环境失调两方面因素共同发挥作用，一方面表现为免疫监视功能的降低、免疫杀伤性细胞的细胞毒作用的减弱而无法有效清除异位内膜，免疫逃逸功能增强以致异位内膜生长。在临床工作中，我们通过腹腔镜手术发现异位病灶处通常伴随着炎症充血，内异症患者表现出具有自身免疫性疾病的特征，其中患者腹腔液中的巨噬细胞、细胞炎性因子、生长因子和血管生成物质等增加，从而促进异位内膜组织的存活、增殖并导致局部纤维结缔组织增生和粘连。前期工作中，我们通过高通量蛋白质组学技术，发现STING(stimulator of interferon genes)基因在子宫内膜异位症在位内膜和正常的内膜组织中存在差异表达。STING即为干扰素刺激因子蛋白，是一种胞内DNA受体蛋白，能识别细胞质中外源性或内源性的双链DNA磷酸化下游TBK1、IRF3等蛋白信号通路，进入细胞核后刺激细胞核释放干扰素b1释放到细胞质内，是一种天然免疫相关蛋白。
研究目的:初步研究STING基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用，深入探究该蛋白在内异症中发挥的功能和潜在的分子机制，为内异症临床诊疗提供新的研究基础。
研究方法:本章节研究共纳入15例内异症在位内膜作为实验组，同时纳入配对15例女性子宫内膜作为对照组，其中4对内膜进行iTRAQ法的高通量蛋白质组学检测差异表达的蛋白质，经过前期研究后，初步筛选得出STING蛋白的差异表达后，用余11对标本进行WB实验和IHC实验验证，在功能实验中，使用子宫内膜基质细胞系(HESC)检测STING蛋白对HESC的增殖、侵袭和迁移水平的影响，另外进一步研究STING蛋白信号通路在基质细胞中所发挥的作用以及对细胞功能的影响。
结果:针对内异症在位内膜蛋白质组学初步筛选后，发现免疫相关分子蛋白是重要组成部分，而其中天然免疫相关的STING蛋白具有显著性差异。随后验证该蛋白表达，根据WB结果发现，STING蛋白在内异症在位内膜组织显著低表达，而对IHC结果分析发现，STING蛋白在正常内膜组织中的基质和腺上皮均有表达，而在内异症中，主要在在位内膜基质部有表达，但在异位内膜组织中，STING主要在腺上皮中表达。进一步研究STING对内膜基质细胞功能的影响后发现，低表达的STING蛋白能够促进基质细胞增殖、侵袭和迁移的能力，与STING密切相关的STING/IRF3/IFNb1信号通路在HESC细胞中，随着STING蛋白的低表达，该信号通路的作用也降低，主要表现为磷酸化的IRF3和TBK1表达降低，IFNb1的分泌水平降低。为了进一步研究STING/IRF3/IFNb1信号通路分泌到胞外的IFNb1对基质细胞功能的影响，我们对低表达STING的基质细胞中外源性加入IFNb1，发现IFNb1能够逆转性降低基质细胞的侵袭和迁移功能，但对细胞增殖水平逆转影响有限。
结论:在本章节中，研究内异症在位内膜发现了具有明确低表达和促进细胞侵袭和迁移功能的STING蛋白，并发现STING蛋白在内异症的表达分布有明显差异，主要是在位内膜的基质和异位内膜的腺上皮表达，同时阐明STING可通过STING/IRF3/IFNb1信号通路在基质细胞中发挥影响细胞侵袭和迁移能力的作用。进一步丰富了天然免疫相关的内异症病因学研究，为进一步拓展内异症的发病机制研究和指导临床治疗工作带来了新思路。