羟胺型离子液体预处理菊芋秸秆发酵产乙偶姻

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基于对化石燃料的枯竭和气候变暖的担忧,采用生物法生产生物基化学品的方式备受青睐,其中使用非粮作物菊芋的秸秆替代传统碳源发酵生产生物基化学品是一个重要的研究方向。但菊芋秸秆因具有复杂的结构而难被酶和微生物直接利用,需先对其进行预处理以提高酶对纤维素和半纤维素的可及性。因此,本课题以菊芋秸秆为原料,利用羟胺型离子液体对菊芋秸秆进行预处理,从预处理后酶对秸秆的水解效果、离子液体对水耐受性和对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生长代谢影响以及预处理后抑制物的生成等角度筛选羟胺型离子液体,并通过响应面对预处理条件优化,最终以一种四碳平台化合物乙偶姻为产物对菊芋秸秆的发酵利用进行研究,为开发高效低成本的木质纤维素预处理技术提供参考。首先本实验合成了6种羟胺型离子液体,通过傅里叶红外色谱和核磁共振对合成的离子液体结构进行表征鉴定,并结合离子液体的理化性质对其预处理木质纤维素的机理进行分析。研究结果表明羟胺型离子液体对木质纤维素的预处理效果受离子液体的氢键碱性和对木质素的溶解性共同影响。基于预处理效率、对水耐受性、水洗后残留以及对B.subtilis生长代谢乙偶姻的影响等因素筛选到乙醇胺乙酸(EOAA)为最佳离子液体,并且EOAA预处理后产生的抑制物较少。在发酵培养基中添加浓度不大于0.3 mol/L的EOAA时,最大细胞密度增加25%,而乙偶姻和2,3-丁二醇的总浓度在添加0.1 mol/L EOAA时比空白对照组高15%。对EOAA预处理条件中的预处理时间、温度和液固比等条件进行单因素和响应面实验优化,最终优化后的预处理条件为:在170°C预处理温度下预处理5 h,体系中液固比为18。此时纤维素和半纤维的回收率分别为87%和75%,利用纤维素酶CTec2在10wt%的固体负载条件下酶解24 h可得到64%的葡萄糖产率和66%的木糖产率。利用转录组测序对低浓度EOAA促进B.subtilis生长代谢的原因进行分析。研究发现0.1 mol/L EOAA可促进菌体代谢通路中调控乙偶姻和2,3-丁二醇合成的bud ABC操纵子的相关酶的转录基因呈现上调现象,这是总产物产量显著提升的主要原因之一。调控糖酵解途径中关键酶的相关酶的转录基因也呈现上调现象,揭示了0.1 mol/L EOAA加快葡萄糖消耗速率的原因。此外还发现与孢子合成有关酶的转录基因均呈现下调状态,芽孢是芽孢杆菌在恶劣条件下的一种自我保护机制,可见0.1 mol/L EOAA的加入对菌体的生长更有利。最后,利用处理后的菊芋秸秆进行高固酶解发酵,优化了高固酶解的酶添加量和补料次数。优化后的酶解条件为:纤维素酶CTec2的添加为45 FPU/g JAS,在固体负载为30wt%的条件下无补料酶解72 h,最终酶解液中葡萄糖浓度可达到135.1 g/L,木糖浓度为46.0 g/L。利用此酶解液为碳源进行批次发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇,最终获得目标产物的产量达到82.8 g/L,相较以糖液为碳源的对照组产量提升了36.4%。
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