目的:随着人们健康意识的增强,肺癌近年检出率呈明显上升趋势,其已逐渐成为全球癌症相关死亡的主要原因之一[1],是严重威胁人类健康和生命的高度恶性肿瘤[2]。肺癌根据其组织病理学特征可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）[3]。其中肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是NSCLC的主要组织学亚型,占所有肺癌病例的40%[4]。目前主流的治疗办法有手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗方案,虽然手术治疗对于早期肺癌效果较好,但是对于中晚期肺癌患者来说,由于手术切除困难、易远处转移、预后差、复发频繁等原因,肺癌仍是一种难治性疾病[5]。LUAD的发生发展过程极其复杂,其诱导转移的机制尚不清楚。因此,迫切需要探索LUAD中肿瘤进展和转移的潜在机制,寻找新的相关治疗靶点。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNAs）是一种新型的非编码蛋白转录本,其长度为超过200个核苷酸[6]。一般通过表观遗传、转录和转录后机制参与肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭和转移等多种生物学过程。此外,作为肿瘤发生和肿瘤进展的关键调控因子,已发现多种LncRNA与LUAD的进展相关。而竞争性内源性RNA（Competitive endogenous RNA,ceRNA）作为阐明LncRNA作用机制的关键,通常被认为是LncRNA和mRNA之间的功能中介,它们与micro RNAs（miRNAs）相互作用,并介导新的“语言”与通信[7]。miRNA可以精确地与mRNA的3＇-非翻译区相互作用,调控转录后的基因表达[8]。一些miRNAs不仅参与肿瘤细胞的增殖和转移,还被认为是LUAD的预后因素[9]。LINC00511作为一种致癌基因,在胃癌[10]、乳腺癌[11]和NSCLC[12]组织和细胞系中高表达,参与细胞增殖、侵袭、转移和凋亡。目前的研究表明,miR-126-5p和miR-218-5p都可以通过ceRNA机制在癌症中发挥生物学作用。但迄今为止,关于miR-126-5p和miR-218-5p在LUAD中的表达水平及其作用机制尚缺乏系统的研究。I型胶原α1链（Collagen type I alpha-1 chain,COL1a1）在肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中高度表达[13-15]。此外COL1a1的差异表达预示着肺鳞状细胞癌患者的不良临床结局（如淋巴结转移）[16]。同时我们在Kaplain-Meier数据库中发现COL1a1的高表达与肺腺癌患者的预后不良高度相关（P＜0.01）。因此,COL1a1具备影响癌细胞存活和转移的基础,被认为是肺肿瘤的预后标志物和潜在的治疗靶点。然而,COL1a1在LUAD中的潜在分子机制仍有待阐明。研究方法:临床样本:LUAD组织及匹配的相邻正常组织均来自中国医科大学附属盛京医院,所有患者均签署知情同意书。纳入标准:（1）所有患者病理诊断为肺腺癌;（2）术前未接受任何放疗或化疗的患者;（3）临床病理资料完整的患者。组织保存在-80℃的冰箱中。细胞培养:LUAD细胞系（A549和PC9）和人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）购于中国科学院细胞库（中国昆明）。所有细胞株在含10%胎牛血清（FBS,Invitrogen）和1%青霉素/链霉素（Gibco,USA）并且是37℃、5%CO2的湿化环境中的RPMI 1640培养基中培养。数据分析:计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示,两组间的统计差异采用Student’s t检验。计数资料采用卡方检验对两组数据进行分析。采用SPSS 21.0统计软件（Chicago,IL,USA）进行统计分析,Graph Pad Prism软件（Version 7.0,CA,USA）作图。p值小于0.05,认为差异有统计学意义。所有实验均重复3次。本研究分为三部分:第一部分主要研究LINC00511基因在肺腺癌组织与细胞中的表达情况,以及沉默LINC00511对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭、细胞凋亡等方面的影响,同时应用裸鼠构建移植瘤模型再次验证LINC00511基因在体内的表达情况。1、RT-qPCR检测35对LUAD组织和匹配的非肿瘤组织中LINC00511的表达情况以及LINC00511在A549和PC9细胞中的表达水平。我们使用TRIzol试剂（Invitrogen,USA）从组织和细胞中分离总RNA。用逆转录试剂盒（Takara）将分离的RNA反转录为c DNA。RT-qPCR采用商用SYBR Premix Dimer Eraser Kit（Takara,中国）进行,并按照ABI 7500 PCR系统（Applied Biosystems）的说明书检测目标mRNA和miRNA的表达水平。GAPDH作为LncRNA（LINC00511）的内对照。目标基因的相对表达水平用2-ΔΔCt方法计算。2、用si-LINC00511转染A549和PC9细胞,特异性沉默LINC00511的表达来探讨其在LUAD发病机制中发挥的作用。2.1选择转染效率较高的小干扰RNA。针对LINC00511转染的小干扰RNA（si-LINC00511 1#和si-LINC00511 2#）及其阴性对照si-NC购买自Gene Pharma（上海,中国）。将细胞以5×10~4/孔的密度接种在24孔板上。根据制造商（Invitrogen公司）的协议,使用Lipofectamine 3000转染试剂完成转染。RT-qPCR分析评估转染效率。转染48h后收集细胞,用于后续实验。设计两种si-LINC00511（si-LINC00511 1#和si-LINC00511 2#）共同验证并选择转染效率进行最高者下一步实验。RT-qPCR方法同前。2.2、细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖能力。转染细胞接种于96孔板（2×10~3个细胞/孔）,在RPMI-1640培养基中分别培养24、48和72小时。随后,用10μL CCK-8试剂孵育细胞4h。最后,使用酶标仪（Bio Tek Instruments）在450nm处定量每孔的光密度（OD）值。2.3、集落形成检测肺腺癌细胞集落形成能力。集落形成实验时,每组细胞以500个/孔的密度接种于6孔板中,培养10天。随后用0.5%结晶紫溶液（Sigma）染色细胞。清洗干净后,在奥林巴斯（Olympus Inc.）显微镜下采集数字图像,并对其进行计数。2.4、流式细胞术分析细胞凋亡。使用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）分析细胞凋亡水平。根据制造商的说明,将A549和PC9细胞以2×10~5/孔的密度接种在6孔板上,孵育72小时后,收获细胞并用膜联蛋白VPE和7-AAD染色。使用流式细胞仪（Agilent,China）检查染色的细胞。2.5、Transwell实验分析转染si-LINC00511后A549和PC9细胞迁移能力和侵袭能力。根据制造商的说明,迁移测定使用24孔transwell室（BD Biosciences）进行。共计1×105转染后的A549和PC9重悬于无血清培养基中,分别接种于transwell板上室。下室中加入含10%血清的培养基600μL。孵育24h后,将下方细胞固定,1%结晶紫染色,然后随机选择4个视野,在显微镜下观察并计数染色细胞。对于侵袭测定,将5×10~5A549和PC9细胞接种到涂有Matrigel（BD Biosciences）的上室中,其他步骤与迁移测定相同。3、肿瘤异种移植模型实验验证下调LINC00511对体内肿瘤生长的影响。空腺病毒载体（Ad-sh-NC）和LINC00511特异性小发夹RNA（Ad-sh-LINC00511）均由Hanbio Technology Ltd.（中国上海）提供并转导至A549细胞中。腺病毒的滴度约为1×1010PFU/ml。腺病毒以感染复数（MOI）100进行转导。所有动物实验均按照机构指南进行,并经伦理委员会批准。BALB/c裸鼠（4-6周龄,体重18-20g）购自上海SLAC实验动物有限公司（中国上海）。每组（六只雄性小鼠）,将用Ad-sh-NC或Ad-sh-LINC00511转染的A549细胞重新悬浮在PBS中。然后将细胞分别以1×10~7个细胞/ml的密度皮下接种到BALB/c小鼠中。注射1周后,每4天使用卡尺测量宽度（W）和长度（L）,监测一次肿瘤体积和大小,根据以下公式估算肿瘤体积:V=（W~2×L）/2。27天后,处死小鼠,切除肿瘤并称重。第二部分主要研究LINC00511如何通过竞争性结合miR-126-5p或miR-218-5p调控COL1a1的表达情况。1、通过系统的文献筛选和生物信息学工具,首先确定数个在LUAD中稳定表达的候选miRNAs。通过RT-qPCR验证候选miRNA的表达水平。初步确定高度相关的目标miRNA。RT-qPCR步骤同前,选择U6作为miRNA（miR-126-5p和miR-218-5p）的内对照。目标基因的相对表达水平用2-ΔΔCt方法计算。2、然后使用在线数据库Target Scan（http://www.targetscan.org/）和Encyclopedia of RNA Interactomes（ENCORI;Starbase v2.0;http://starbase.sysu.edu.cn/）用于预测LINC00511、miR-126-5p和miR-218-5p的潜在靶序列。寻找目的miRNA与LINC00511潜在的结合位点,并预测LINC00511野生型和突变型结构示意图。3、进行双荧光素酶报告试验验证LINC00511是否与目标miRNA结合。构建pmir GLO双荧光素酶miRNA靶表达载体（Promega）,生成野生型荧光素酶报告载体（LINC00511-WT）和相应的突变体（LINC00511-MUT）。上述荧光素酶报告载体和miR-126-5p模拟物、miR-218-5p模拟物或miR-NC与A549细胞共转染。48小时后,使用双荧光素酶报告系统（Promega,USA）测量荧光素酶活性。4、RNA下拉实验证实LINC00511与miR-126-5p和miR-218-5p相互作用关系。miR-126-5p、miR-218-5p和miR-NC生物素标记为Bio-miR-126-5p、Bio-miR-218-5p和Bio-NC,并转染到细胞中。转染48小时后,收集并裂解细胞。细胞裂解液与Dynabeads M-280链霉亲和素（Invitrogen,CA）共同孵育2小时,使链霉亲和素与生物素结合,然后用生物素洗脱缓冲液洗脱。最后,将生物素偶联RNA复合物拉下,进行RT-qPCR检测目的基因的富集情况。5、检测了LUAD细胞中miR-126-5p和miR-218-5p的表达水平。应用RT-qPCR方法检测miR-126-5p或miR-218-5p是否参与LUAD的进展。6、生信分析预测miR-126-5p和miR-218-5p的下游靶点。在线数据库Target Scan（http://www.targetscan.org/）和Encyclopedia of RNA Interactomes（ENCORI;Starbase v2.0;http://starbase.sysu.edu.cn/）用于预测LINC00511、miR-126-5p和miR-218-5p的潜在靶序列。然后,对LUAD中重叠的miR-126-5p和miR-218-5p靶基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）分析,并使用Jvenn（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）进行可视化。7、查阅Kaplain-Meier数据库分析COL1a1与肺腺癌患者的预后的关系。8、双荧光素酶报告分析。构建pmir GLO双荧光素酶表达载体（Promega）,生成野生型荧光素酶报告载体（COL1a1-WT）和相应的突变体（COL1a1-MUT）。上述荧光素酶报告载体和miR-126-5p模拟物、miR-218-5p模拟物或miR-NC与A549细胞共转染。48小时后,使用双荧光素酶报告系统（Promega,USA）测量荧光素酶活性。验证miR-126-5p和miR-218-5p是否直接与COL1a1结合。9、RNA pull-down实验再次验证COL1a1与miR-126-5p、miR-218-5p的结合关系。实验方法同前。10、应用RT-qPCR方法检测COL1a1在LUAD细胞中的表达情况。GAPDH作为mRNA（COL1a1）和LncRNA（LINC00511）的内对照。目标基因的相对表达水平用2-ΔΔCt方法计算。11、将si-NC、si-LINC00511、anti-NC+si-LINC00511、anti-miR-218-5p+si-LINC00511或anti-miR-126-5p+si-LINC00511转染到A549细胞中,分别行RT-qPCR和Western blot实验来验证LINC00511基因的下调对COL1a1 mRNA和蛋白的表达的影响。同时明确miR-126-5p或miR-218-5p的下调能否挽救LINC00511沉默介导的COL1a1 mRNA和蛋白表达的降低。Western blot实验时用RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白质。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific,USA）对蛋白质进行定量。将30μg变性蛋白质样品用10%SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜上。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭2小时。随后,与COL1a1（1:1000,Abcam,UK）的一抗在4℃条件下孵育过夜。然后,二抗在室温下孵育1小时。最后,使用ECL试剂进行蛋白质可视化（Millipore,USA）。GADPH被用作内部对照。第三部分主要研究COL1a1过表达能否逆转LINC00511沉默对LUAD的影响,并预测COL1a1下游通路。1、RT-qPCR实验确认过表达COL1a1能否使COL1a1 mRNA表达水平提高。将COL1a1序列插入到pc DNA3.1载体（Invitrogen）中增强COL1a1的表达（pc DNA3.1-COL1a1,COL1a1）,以空的pc DNA3.1载体作为阴性对照（vector）。将细胞以5×10~4/孔的密度接种在24孔板上。根据制造商（Invitrogen公司）的协议,使用Lipofectamine 3000转染试剂完成转染。RT-qPCR分析评估转染效率。转染48h后收集细胞,用于后续实验。通过将COL1a1过表达载体（COL1a1）或空载体转染到A549和PC9细胞中来证实COL1a1是否能与LINC00511相互作用参与LUAD进展。2、集落形成实验和CCK-8实验验证COL1a1上调能否逆转si-LINC00511导致的细胞增殖能力降低。拯救实验将A549和PC9细胞分别转染si-NC、si-LINC00511、si-LINC00511+vector和si-LINC00511+COL1a1。转染及RT-qPCR步骤同前。3、流式细胞法分析COL1a1过表达能否逆转LINC00511基因敲减对细胞凋亡的作用。转染及细胞凋亡检测试剂盒操作步骤同前。4、transwell实验验证COL1a1过表达能否逆转LINC00511基因敲减对细胞迁移和侵袭的作用。转染及迁移侵袭实验同前。5、将A549和PC9细胞分别转染si-NC、si-LINC00511、si-LINC00511+vector和si-LINC00511+COL1a1,分别行RT-qPCR和Western blot实验明确LINC00511沉默组能否改变PI3K和AKT的磷酸化水平,同时确认COL1a1过表达有无逆转作用。RT-qPCR步骤同前。Western blot实验时用RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白质。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific,USA）对蛋白质进行定量。将30μg变性蛋白质样品用10%SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜上。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭2小时。随后,与COL1a1（1:1000,Abcam,UK）、PI3K（1:50 00,Abclonal Technology,USA）、p-PI3K（1:50 00,Cell Signaling Technology,USA）、AKT（1:50 00,Cell Signaling Technology,USA）、p-AKT（1:50 00,Cell Signaling Technology,USA）的一抗在4℃条件下孵育过夜。然后,二抗在室温下孵育1小时。最后,使用ECL试剂进行蛋白质可视化（Millipore,USA）。GADPH被用作内部对照。结果:第一部分1、与相邻正常组织相比,LINC00511在LUAD组织中高表达。同时LINC00511在A549和PC9细胞中的表达水平也明显高于人正常支气管上皮细胞BEAS-2B。2、si-LINC00511显著下调LINC00511的表达。CCK-8实验显示,与对照组相比LINC00511基因的敲低显著减弱了A549和PC9细胞的增殖能力。集落形成实验显示,与对照组相比,LINC00511基因的敲低显著减弱了A549和PC9细胞的集落形成能力。流式细胞术分析显示,下调LINC00511显著提高了A549和PC9细胞的凋亡,证实了si-LINC00511的抗癌作用。转染si-LINC00511的A549和PC9细胞的迁移和侵袭能力均弱于对照组。3、Ad-sh-LINC00511组小鼠种植肿瘤体积和重量明显较小,同时生长速度也明显更慢。以上实验结果提示,通过下调LINC00511的表达,可以抑制裸鼠的肿瘤进展。第二部分1、LINC00511沉默后,两个miRNAs（miR-126-5p和miR-218-5p）的表达显著升高。2、对LINC00511进行了生物信息学分析,发现miR-126-5p和miR-218-5p与LINC00511有几个潜在的结合位点。在A549细胞中进行了双荧光素酶报告试验结果表明LINC00511可以直接与miR-126-5p或miR-218-5p结合。同样,RNA下拉分析显示LINC00511可以富集在Biotin-miR-126-5p-WT或Biotin-miR-218-5p-WT样品中。3、与正常细胞相比,A549和PC9细胞中miR-126-5p和miR-218-5p呈相对低表达。4、生物信息学分析显示,COL1a1 3’-UTR与miR-126-5p和miR-218-5p具有结合位点。同时我们在Kaplain-Meier数据库中发现COL1a1的高表达与肺腺癌患者的预后不良高度相关（P＜0.01）。5、双荧光素酶报告数据显示,与miR-126-5p模拟物或miR-218-5p模拟物共转染后,COL1a1 3’-UTR WT的荧光素酶活性显著降低（P＜0.001）,RNA pull-down实验证实了COL1a1与miR-126-5p、miR-218-5p的结合关系。6、COL1a1在LUAD细胞系中高表达,其中PC9的COL1a1表达量最高。7、RT-qPCR和Western blot数据显示,LINC00511基因的下调显著抑制了COL1a1 mRNA和蛋白的表达,但miR-126-5p或miR-218-5p的下调挽救了LINC00511沉默介导的COL1a1 mRNA和蛋白表达的降低。第三部分1、A549细胞在COL1a1过表达中转染效率更高。2、集落形成实验和CCK-8实验显示,si-LINC00511可导致细胞增殖能力明显降低,而COL1a1上调则逆转了这一趋势。流式细胞法分析COL1a1过表达可以逆转LINC00511基因敲减对细胞凋亡的促进作用。transwell实验表明,COL1a1过表达能逆转LINC00511基因敲低对细胞迁移和侵袭的抑制作用。3、WB实验及RT-qPCR实验均验证,LINC00511沉默组的PI3K和AKT磷酸化水平较对照组明显降低,而COL1a1过表达部分恢复了LINC00511缺失引起的p-PI3K和p-AKT蛋白的低表达。结论:1、Linc00511可促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,诱导PI3K/AKT信号通路的激活。2、Linc00511通过竞争性结合miR-126-5p/miR-218-5p调控COL1A1的表达,而COL1a1过表达可逆转Linc00511下调对LUAD增殖、侵袭、迁移、凋亡,以及对p-PI3K和p-AKT蛋白的影响。