背景:谷氧还蛋白(Glutaredoxin，GLRX)是硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)家族成员之一，与Trx系统一起发挥抗氧化应激、维持细胞和机体氧化还原稳态的作用。目前已发现的人类GLRX包括GLRX1、GLRX2、GLRX3和GLRX5四种，其中GLRX1和GLRX2属于双巯基形式，而GLRX3和GLRX5则为单巯基蛋白。每种GLRX都有其特殊的结构与功能，双巯基GLRX主要维持细胞氧化还原状态，而单巯基GLRX则在细胞铁硫簇转运及铁代谢平衡方面发挥重要作用。　　已发现的人类四种GLRX中，GLRX2、GLRX3和GLRX5均可与铁硫簇（Iron-sulfur cluster，ISC）结合。两分子GLRX2单体和一个[2Fe-2S]以及两分子谷胱甘肽(glutathione，GSH)构成2GLRX2-[2Fe-2S]-2GSH二聚体。每个铁同时与一个GLRX2和一个GSH的半胱氨酸(Cysteine，Cys)的巯基（-SH）结合，GLRX2提供-SH的Cys是活性位点-C-S-Y-C-中的第一个Cys。GLRX3二聚体的晶体结构尚未被解析，根据各结构域表现的特征推测两分子GLRX3单体与两个[2Fe-2S]及四分子的GSH构成，同样GLRX3活性位点(C-G-F-S)和GSH分别提供Cys的-SH与铁结合，构成2GLRX3-2[2Fe-2S]-4GSH二聚体。　　GLRX3位于细胞质，以[2Fe-2S]作为“开关”，在游离的单体和结合铁硫簇的二聚体形式之间转换，可作为细胞铁感受器(iron sensor)，调控铁转运和铁代谢平衡。铁调节蛋白1(Iron regulatory protein1，IRP1)也位于细胞质，扮演着铁感受器的角色。当细胞铁含量升高时，IRP1与[4Fe-4S]结合，转换为顺乌头酸酶。而当细胞铁含量降低时，IRP1则与[4Fe-4S]解离，与铁代谢相关蛋白非翻译区(Untranslated regions，UTRs)的mRNA结合，促进细胞铁吸收，减少细胞铁储存，从而提高细胞铁水平。　　目的:(1)体外条件下，人GLRX3蛋白能否将结合的铁硫簇转运至不带辅基的IRP1(apo-IRP1);(2)人GLRX3蛋白除了结合[2Fe-2S]，能否结合其他形式的铁硫簇;(3)GLRXs和GSH在铁硫簇转运中的作用。　　方法:PCR扩增人GLRX3基因，通过酶切和连接等常规分子克隆方法构建重组原核表达质粒pQE80L-GLRX3-his6，转化感受态大肠细菌BL21(DE3)。IPTG诱导BL21(DE3)表达可溶性GLRX3-his6融合蛋白，收集细菌沉淀超声破碎后，无氧条件下经Ni-NTA纯化柱分离纯化蛋白，SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色确定目的蛋白的表达，紫外光谱扫描鉴定纯化的GLRX3蛋白是否含有铁硫簇。无氧条件下，将纯化出的GLRX3蛋白与apo-IRP1共培养，测定IRP1顺乌头酸酶活性，从而确定GLRX3蛋白是否将其结合的铁硫簇转运给apo-IRP1。分别在含或不含GSH的条件下，在GLRX3蛋白上体外无氧组装铁硫簇，由硫化钠(sodium sulfide，Na2S)和柠檬酸铁铵（Ferric ammonium citrate，FAC）分别作为硫源和铁源，并对组装复合物进行紫外光谱扫描，确定GLRX3是否与铁硫簇组装成功，并推测铁硫簇的类型;同时在无氧条件下，将组装产物与apo-IRP1共培养，测定IRP1顺乌头酸酶活性。在HEK293T细胞中过表达GLRX2蛋白，测定细胞含铁硫簇蛋白顺乌头酸酶活性的变化;在HEK293T细胞中用丁硫氨酸亚砜胺(buthioninesulfoximine，BSO)抑制GSH的合成，或用二酰胺(diamide)促进巯基蛋白的氧化，测定细胞线粒体和胞质顺乌头酸酶活性的变化。在含或不含GLRX3的条件下，体外转运GLRX2的铁硫簇至apo-IRP1，观察GLRX3对GLRX2铁硫簇转运的影响。　　结果:(1)无氧条件下纯化的GLRX3-his6融合蛋白呈棕褐色，紫外光谱扫描含有铁硫簇特征峰，并能快速（30 min内）转运铁硫簇至apo-IRP1，使之具有顺乌头酸酶的活性，所以转运给IRP1的铁硫簇为[4Fe-4S]。推测[4Fe-4S]来源之一:结合铁硫簇的GLRX3与apo-IRP1反应过程中，两个[2Fe-2S]反应生成一个[4Fe-4S]，再转运至apo-IRP1;来源之二:GLRX3除了与[2Fe-2S]结合外，还能与[4Fe-4S]结合，并将结合的[4Fe-4S]快速转运至apo-IRP1。(2)体外纯化的融合蛋白GLRX2-his6与GLRX3-his6紫外光谱扫描铁硫簇特征峰不一致;GLRX2二聚体晶体结构已证实GLRX2所含铁硫簇为[2Fe-2S]，GLRX2可将与其结合的铁硫簇转运给apo-IRP1，但速度远远慢于GLRX3，2小时转运效率达最高。以上结果提示GLRX3可能直接结合了[4Fe-4S]。(3)在含GSH的情况下，GLRX3可装配铁硫簇，但装配产物并不能快速（30 min内）转运其铁硫簇至apo-IRP1，结合紫外光谱扫描推测为[2Fe-2S]。(4)在无GSH存在的情况下，GLRX3也可以与铁硫簇结合，且快速（30 min内）转运其铁硫簇至apo-IRP1，结合紫外光谱扫描推测为[4Fe-4S]。(5)HEK293T细胞中过表达GLRX2的线粒体亚型蛋白(GLRX2a)后，细胞线粒体(m-aco)和胞质顺乌头酸酶(c-aco)活性均显著下降，可能由于过表达的线粒体apo-GLRX2a干扰了线粒体内铁硫簇的转运，夺取了部分铁硫簇，导致向m-aco和c-aco转运的铁硫簇减少。(6)HEK293T和MEL细胞中GSH合成受限，导致细胞顺乌头酸酶活性下降，其中c-aco下降较m-aco更明显，提示GSH在铁硫簇从线粒体转运至胞质的过程中发挥一定的作用。(7)体外转运GLRX2的铁硫簇至apo-IRP1的过程中，GLRX3可抑制铁硫簇向IRP1的转运，提示GLRX3与IRP1竞争得到GLRX2的铁硫簇，可能与铁硫簇的转运相关。　　结论:1）单巯基蛋白GLRX3不仅可以与[2Fe-2S]结合，还可以与[4Fe-4S]结合，且能快速转运铁硫簇至apo-IRP1，可能与IRP1共同调节细胞铁代谢平衡。2) GLRX2、GSH和GLRX3在铁硫簇从线粒体向胞质的转运过程中发挥一定的作用。