论文部分内容阅读
[目 的]肺癌全球高发,肺腺癌是最广泛的肺癌亚型,现有的肺腺癌的靶点以及靶向治疗有所局限,仅能满足部分肺腺癌患者。因此,寻求新的肺腺癌分子靶点迫在眉睫。蛋白质磷酸酶1（PP1）是真核细胞中常见的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与调节细胞的多种生理过程,PP1抑制剂通常被认为是肿瘤促进剂。蛋白磷酸酶1调节亚基14D（PPP1R14D）是一种有效的PP1抑制剂,然而,它在肿瘤发展中的作用在很大程度上还不清楚。本研究旨在探讨PPP1R14D在肺腺癌中的表达、功能及其作用机制。[方 法]1.利用GEPIA数据库分析PPP1R14D在肺腺癌、肺鳞癌与正常肺组织中的表达差异。采用Kaplan Meier plotter数据库分析PPP1R14D的表达对肺腺癌、肺鳞癌患者生存的影响。通过IHC技术检测PPP1R14D在临床肺腺癌患者组织标本中的表达情况,统计并分析PPP1R14D与肺腺癌患者临床特征的关系。2.利用Western blot实验检测PPP1R14D蛋白在肺腺癌、肺鳞癌以及正常支气管上皮细胞系中的基础表达水平,筛选PPP1R14D高表达的两株肺腺癌细胞株作为后续实验细胞株。利用shRNA慢病毒构建敲减PPP1R14D的肺腺癌细胞模型,Western blot检测其敲减效果。利用MTS细胞增殖实验、EdU细胞增殖实验、平板克隆形成实验、流式细胞周期实验检测PPP1R14D对肺腺癌增殖的作用。利用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测PPP1R14D对肺腺癌迁移和侵袭的作用。利用Western blot实验检测PPP1R14D对细胞周期相关蛋白以及迁移、侵袭蛋白表达的影响。3.通过构建裸鼠皮下异体移植瘤模型检测PPP1R14D对肺腺癌细胞体内成瘤和增殖的影响。4.利用Western blot实验检测PPP1R14D对BRAF/MEK/ERK信号通路及其上游Kras和PKCα蛋白表达的影响。[结 果]1.GEPIA数据库分析显示PPP1R14D在肺腺癌中的表达明显高于其在正常肺组织中的表达（P＜0.05）,而PPP1R14D在肺鳞癌中的表达和其在正常肺组织中的表达并无差异（P＞0.05）。Kaplan Meier plotter数据库分析显示PPP1R14D高表达的肺腺癌患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）明显短于PPP1R14D低表达的肺腺癌患者（P＜0.05）,然而,PPP1R14D的表达对肺鳞癌患者的OS和PFS无明显影响（P＞0.05）。IHC结果显示PPP1R14D在肺腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织（P＞0.05）,PPP1R14D的表达与患者的年龄呈负相关,更为重要的是PPP1R14D表达与患者AJCC分期呈正相关（P＞0.05）。2.与正常支气管上皮细胞BEAS-2B相比,PPP1R14D在H226鳞癌细胞系中是低表达的（P＞0.05）,而 PPP1R14D 在 A549、PC-9 以及 SPC-A-1肺腺癌细胞系中高表达（P＜0.05）,因此,选取A549及PC-9细胞作为后续实验细胞。与对照Scramble组相比,慢病毒shPPP1R14D-1与shPPP1R14D-2能显著敲减A549及PC-9细胞中PPP1R14D的内源性表达（P＜0.05）。MTS、EdU细胞增殖实验以及平板克隆形成实验显示敲减PPP1R14D能显著抑制A549和PC-9细胞的体外增殖能力（P＜0.05）。流式细胞周期检测发现敲减PPP1R14D将A549和PC-9细胞的周期阻滞在G1期（P＜0.05）。周期相关蛋白检测结果显示敲减A549和PC-9细胞的内源性PPP1R14D,G1期相关蛋白c-Myc、CDK2以及Cyclin E1表达显著降低（P＜0.05）。划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验结果显示敲减PPP1R14D能显著抑制A549和PC-9细胞的体外迁移和侵袭能力（P＜0.05）。迁移及侵袭相关蛋白检测结果显示敲减A549和PC-9细胞的内源性的PPP1R14D,MMP2和MMP9的表达显著降低（P＜0.05）。3.裸鼠皮下成瘤实验显示敲减内源性的PPP1R14D能明显抑制A549细胞体内成瘤能力及增殖能力,与Scramble组相比,敲低PPP1R14D的瘤体的生长速度、大小以及湿重均降低（P＜0.05）。4.Western blot实验证实在A549和PC-9细胞中敲减PPP1R14D,可抑制BRAF/MEK/ERK信号通路中的关键蛋白BRAF、p-BRAF、p-MEK1及p-ERK1/2的表达（P＜0.05）,该信号通路经典上游Kras蛋白的表达虽无影响（P＞0.05）,但另一影响该通路的关键蛋白p-PKCα随PPP1R14D的敲低而降低（P＜0.05）。[结 论]1.PPP1R14D高表达于肺腺癌,与肺腺癌患者的AJCC分期晚及不良预后密切相关。2.敲减PPP1R14D的表达抑制肺腺癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭和裸鼠体内增殖能力。3.PPP1R14D可能通过激活PKCα/BRAF/MEK/ERK信号通路促进了肺腺癌的增殖、迁移和侵袭。