【摘 要】
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[目 的]研究节律基因Per1对辐射诱导的肺腺癌A549细胞衰老的影响,并通过ATM蛋白活化、细胞周期分布、衰老相关分泌表型等变化探讨其发生的机制。[方 法]1.将过表达Per1的重组慢病毒载体Lv-Per1转染入A549细胞,q-PCR和Western Blot检测Per1过表达效率,建立稳定转染A549P+细胞株,同时建立非特异性序列阴性对照细胞株A549NC。2.SA-β-gal细胞衰老实验
【基金项目】
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云南省基础研究计划202101AY070001-162；
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[目 的]研究节律基因Per1对辐射诱导的肺腺癌A549细胞衰老的影响,并通过ATM蛋白活化、细胞周期分布、衰老相关分泌表型等变化探讨其发生的机制。[方 法]1.将过表达Per1的重组慢病毒载体Lv-Per1转染入A549细胞,q-PCR和Western Blot检测Per1过表达效率,建立稳定转染A549P+细胞株,同时建立非特异性序列阴性对照细胞株A549NC。2.SA-β-gal细胞衰老实验检测A549P+、A549NC在8Gy X线照射后第12h、24h、36h、48h细胞衰老的情况。3.流式细胞术检测A549P+、A549NC在辐照后不同时间段细胞周期分布情况。4.ELISA检测A549P+、A549NC在辐照后不同时间段细胞培养液中衰老相关分泌表型的情况,包括CXCL-1、IL-6、IL-12。5.8Gy X线照射转染细胞,照射后分别采用q-PCR检测不同时间段细胞中Per1和ATM的mRNA表达情况,Western Blot检测PER1、ATM、p-ATM蛋白表达情况。[结 果]1.荧光显微镜下观察转染阳性率＞90%,q-PCR和Western Blot结果显示Per1的mRNA和蛋白表达量均较对照组显著升高,差异具有统计学意义,成功构建Per1过表达稳定转染细胞株A549P+和阴性对照细胞株A549NC。2.SA-β-ga1细胞衰老实验结果显示:A549细胞辐照后出现衰老,在第48小时最明显,A549P+组中衰老细胞阳性率高于A549NC组,差异具有统计学意义。3.流式细胞术实验结果显示:辐照后,G2/M期细胞比例显著增加,A549P+组G2/M期细胞比例在第12h、36h高于A549NC组,差异具有统计学意义。4.ELISA实验结果显示:辐照后,CXCL-1、IL-6、IL-12的分泌量随时间的延续总体呈增加的趋势,A549P+组第 12h、48h 的 CXCL-1 低于 A549NC 组,第 24h、48h 的 IL-6低于A549NC组,A549P+组的IL-12在第36h、48h高于A549NC组,差异具有统计学意义。5.q-PCR结果显示:A549P+组Per1 mRNA均高于A549NC组;经8Gy X线照射后,Per1 mRNA的表达随时间的延续总体呈增加的趋势,A549P+组四个时间点的表达量均低于未照射组,A549P+组ATM mRNA第24h高于A549NC组,差异具有统计学意义。6.Western Blot结果显示:辐照后,PER1蛋白的表达量随时间延续呈先减少后增加的趋势,A549P+组第24h、36h、48h均低于未辐照组,A549P+组第24h、36h、48h均高于A549NC组,A549P+和A549NC组p-ATM/ATM的比值均高于未辐照组,A549P+组第24h的p-ATM/ATM的比值低于A549NC组,A549P+组最高峰为辐照后第12h,A549NC组最高峰为辐照后第24h,差异具有统计学意义。[结 论]1.节律基因Per1可促进辐射诱导的A549细胞衰老。2.Per1可能通过影响ATM活性调节G2/M期阻滞和衰老相关分泌表型来调控辐射诱导的A549细胞衰老。
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