【摘 要】
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[目的]丁酸是肠黏膜上皮细胞的首要能量来源,主要以丁酸盐形式存在,如丁酸钠（NaB）。丁酸钠具有一定的抗炎和抗肿瘤作用,有研究表明丁酸钠可以通过上调LL-37表达抑制结直肠癌的发生发展,但其具体机制尚未完全明确。本课题拟通过体内、外分子生物学实验,验证丁酸钠对人结肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用及其对LL-37表达的调控作用,并探索其具体的分子机制。[方法]1.利用 CCK-8 法检测不同浓度（3.1
【基金项目】
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2021年昆明医科大学研究生创新基金项目《丁酸钠调控结肠癌细胞LL-37及其分子机制研究》（项目编号:2021S244）；
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[目的]丁酸是肠黏膜上皮细胞的首要能量来源,主要以丁酸盐形式存在,如丁酸钠（NaB）。丁酸钠具有一定的抗炎和抗肿瘤作用,有研究表明丁酸钠可以通过上调LL-37表达抑制结直肠癌的发生发展,但其具体机制尚未完全明确。本课题拟通过体内、外分子生物学实验,验证丁酸钠对人结肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用及其对LL-37表达的调控作用,并探索其具体的分子机制。[方法]1.利用 CCK-8 法检测不同浓度（3.125mM、6.25mM、12.5mM、25mM、50mM、75mM、100mM、150mM）NaB 处理后人结肠癌细胞（HCT116、HT29、SW620、SW480及RKO）的增殖情况,计算出五株细胞分别经NaB处理24h、48h、72h后的IC50。2.采用EdU细胞增殖检测法、细胞平板克隆法检测用不同剂量NaB处理人结肠癌细胞（HCT116:0mM、0.7mM、1.4mM、2.8mM;HT29:0mM、2mM、4mM、8mM;SW620:0mM、3mM、6mM、12mM）48h 对其增殖能力的影响;利用划痕实验、Transwell实验检测不同剂量NaB处理48h对人结肠癌细胞迁移与侵袭能力的影响。3.通过WB技术检测不同剂量NaB处理人结肠癌细胞（HCT116、HT29、SW620）48h后其蛋白水平的改变,观察各组LL-37及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、NICD、RBPSUH、HES1表达水平的变化;通过WB技术检测Notch1激动剂及 NaB 处理（NC 组、Jagged-1 组、Jagged-1+NaB 组）48h 后各组 LL-37及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、NICD、RBPSUH、HES1表达水平的变化。4.用HCT116细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,分为空白对照组和NaB处理组,构建模型15天后每隔一天分别用生理盐水及NaB处理（1.1mg/cm3）,观察NaB对裸鼠皮下荷瘤生长的影响;构建模型36天后处死裸鼠,取裸鼠皮下荷瘤组织提取总蛋白,检测NaB处理裸鼠皮下荷瘤后各组LL-37及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、NICD、RBPSUH、HES1表达水平的变化。[结果]1.CCK-8实验结果显示NaB对结肠癌细胞增殖具有抑制作用,且其抑制作用随药物作用时间和浓度的增加而增强,呈现出时间-剂量-效应关系;根据拟合曲线计算得出 24h 的 IC50（HCT116）=11.499mM、IC50（HT29）=12.700mM、IC50（SW620）=37.100mM、IC50（SW480）=61.539mM、IC50（RKO）=65.288mM;48h 的 IC50（HCT116）=1.358mM、IC50（HT29）=4.336mM、IC50（SW620）=5.994mM、IC50（SW480）=5.923mM、IC50（RKO）=11.361mM;72h 的 IC50（HCT116）=1.089mM、IC50（HT29）=3.232mM、IC50（SW620）=2.902mM、IC50（SW480）=4.640mM、IC50（RKO）=3.677mM。2.EdU-555细胞增殖实验结果显示NaB显著抑制了人结肠癌细胞的EdU 阳性率,且随NaB浓度升高EdU阳性率降低（P＜0.05）;细胞平板克隆实验结果显示NaB抑制了结肠癌细胞克隆形成数量及克隆形成体积,且随着NaB浓度的增加,细胞集落数显著变少、其体积也显著变小（P＜0.05）;划痕实验结果显示NaB抑制了结肠癌细胞的迁移,且NaB浓度越高相对迁移率越小（P＜0.05）;Transwell实验结果显示NaB抑制了结肠癌细胞穿过聚碳酸酯膜,且NaB浓度越高抑制作用越明显（P＜0.05）。3.WB实验结果显示,经不同剂量NaB处理后的结肠癌细胞其Notch1信号通路相关蛋白Notch1、NICD、RBPSUH、HES1的表达水平下降,而LL-37蛋白表达水平升高,且其变化具有一定浓度依赖性（P＜0.05）;加入Notch1信号通路激动剂后,Notch1信号通路相关蛋白表达水平明显升高,且LL-37蛋白表达水平降低（P＜0.05）;而在激活Notch1信号通路的同时加入NaB处理后,Notch1信号通路相关蛋白表达水平降低,而LL-37蛋白表达水平升高（P＜0.05）。4.在裸鼠皮下荷瘤模型中,NaB抑制了裸鼠皮下荷瘤组织的生长（P＜0.05）;WB实验结果显示在体内实验中NaB同样可以抑制Notch1信号通路的激活,并上调LL-37蛋白的表达水平（P＜0.05）。[结论]1.NaB能抑制人结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭。2.NaB可能通过抑制人结肠癌细胞Notch1信号通路来上调LL-37蛋白的表达从而发挥抗癌作用。3.NaB可以通过抑制Notch1信号通路抑制裸鼠皮下荷瘤的生长。
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