【摘 要】
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[目 的]探讨肺腺癌中KRAS突变状态与肿瘤浸润性记忆B细胞之间的联系,分析相关机制与共表达基因,及是否有作为预后标志物与免疫治疗预测标志物的可能性。[方法]1.生物信息学分析:（1）通过数据库中转录组测序数据将肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）病例分为两组进行浸润性免疫细胞浸润分数的估算,选择含量较高、差异明显的记忆B细胞（Memory B cell,MBC）进行接下来的
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860513）；
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[目 的]探讨肺腺癌中KRAS突变状态与肿瘤浸润性记忆B细胞之间的联系,分析相关机制与共表达基因,及是否有作为预后标志物与免疫治疗预测标志物的可能性。[方法]1.生物信息学分析:（1）通过数据库中转录组测序数据将肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）病例分为两组进行浸润性免疫细胞浸润分数的估算,选择含量较高、差异明显的记忆B细胞（Memory B cell,MBC）进行接下来的研究。通过对病例临床数据的统计分析,生存分析,了解Kirsten鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）突变与MBC浸润分数的临床意义及对病例预后的影响。（2）对分组的病例进行差异基因（The differentially expressed genes,DEGs）分析、通路富集分析与基因共表达分析,探讨MBC浸润分数与KRAS突变状态的联系。（3）通过DEGs建立风险评分模型,验证模型对MBC浸润分数及对预后情况的预测能力,并分析模型涉及单基因的预测能力。2.免疫荧光（Immunofluorescence,IF）双染验证MBC浸润情况:收集基因检测确诊为KRAS突变型及KRAS野生型的患者经手术切除的样本组织,使用肿瘤组织石蜡包埋切片（Formalin fixatio and paraffin embedding,FFPE）对MBC表面标志物CD19、CD27进行IF染色,计算MBC浸润分数,验证第一部分结果。3.分析所选基因细胞水平表达情况:使用两株KRAS突变型LUAD细胞株A549、NCI-H1734与一株KRAS野生型LUAD细胞株NCI-H1975,通过实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）在细胞水平对风险评分模型中的入选基因在各株细胞内表达差异进行比较。4.选择差异较大的基因进行生信分析:了解其与主要通路的相关性,探讨其与免疫检查点抑制剂治疗的相关性及对免疫治疗响应的预测能力。[结果]1.MBC浸润分数在KRAS突变型LUAD中显著降低（p＜0.05）,且其浸润分数的降低与病例的预后总生存期较差相关（p＜0.05）;男性病例的MBC浸润分数相较于女性更低。MBC浸润分数的高低、KRAS突变状态均与细胞粘附、胆固醇代谢、细胞分化周期等通路相关;使用DEGs建立的风险评分模型为:Riskscore=（0.2875）*GAR1+（0.136）*DNER+（-0.1311）*ATP7B+（0.0973）*IGFBP1+（0.2663）*GNPNAT1+（0.0646）*FAM83A,经过验证,该模型有良好的预测MBC浸润水平及预后能力。所涉及6个基因中的5个风险基因亦具有良好的单基因预测能力（p＜0.05）。2.IF双染验证了 KRAS突变型LUAD的MBC浸润分数低的结果。3.IGFBP1在携带KRAS突变的细胞株中均显著上调（p＜0.05）,FAM83A在携带KRAS突变的细胞株中均显著下调。4.两个基因表达的上调均导致了更差的预后;两个基因与细胞粘附通路显著相关;两个基因的表达均与CD8+T细胞的浸润分数负相关,且低表达FAM83A、IGFBP1的病例对免疫治疗的响应更好。[结论]1.KRAS的突变会导致肿瘤组织浸润性MBC浸润分数降低,两者均会导致较差的预后。KRAS突变型LUAD组织中MBC浸润分数的变化可能与细胞粘附、胆固醇代谢、细胞分化等过程相关;2.根据共表达基因所构建的风险评分模型对KRAS突变型LUAD患者的MBC浸润情况及预后情况有较准确的预测能力,为后续建立预后模型奠定了基础;3.FAM83A及IGFBP1可能是导致KRAS突变型患者MBC改变的关键基因,在LUAD患者中测定其表达可能有着重要的指导预后作用,低表达FAM83A、IGFBP1的病人可能更适于免疫检查点抑制剂治疗,FAM83A、IGFBP1可能作为免疫治疗预测标志物。
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